Способ получения рестриктазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GTCGAC Советский патент 1992 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/41 

Изобретение относится к микробиологии и генной инженерии, в частности к получению эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GTCGAC.

Известен ряд способов получения ре- стриктаз, узнающих и расщепляющих в ДНК последовательность нуклеотидов GTCGAC, но большинство из них имеют небольшие выходы фермента ввиду низкой продуктивности штаммов микроорганизмов и трудоемкие процессы очистки ферментов,

Известен способ получения эндонуклеазы рестрикции Sal GI способной узнавать

и расщеплять последовательность нуклеотидов GTCGAC.

Недостатком способа является трудоемкость, так как он включает четыре хроматографии (Био-гель А-0,5 т, ДЕАЕ-целлюлоза ДЕ-52. аминопентил-се- фароза и фосфоцеллюлоза Р-11). Штамм содержит две рекстриктазы: Sal GI и Sal Gil, что затрудняет процесс очистки. Выход фермента не указан.

Известен способ получения эндонуклеазы рестрикции Sal GI путем также четырех хроматографии (фосфоцеллюлоза Р-11, ДЕАЕ-сефадекс А-50, гепарин-агароза и гидроксилапатит).

х|

сл го XI

ON

ю

Недостатками способа являются сложность процесса очистки, содержание в штамме двух рестриктаз Sal GI и Sal Gil. Выход фермента по активности на конечном этапе составляет 0,8 % от исходного. Получаемый препарат рестриктазы Sal GI нестабилен при хранении.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ получения эндонуклеазы рестрикции Sai GI, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GTCGAC. Способ включает культивирование Streptomyces albus G на среде Гаузе в течение 3 сут, сбор биомассы центрифугированием, дезинтеграцию клеток ультразвуком, центрифугирование и хроматографии на колонках с Био-гелем А- 0,5 m и гепарин-сефарозой с последующим диализом.

Недостатками способа являются использование в качестве штамма - продуцента S.albus, содержащего две рестриктазы Sa GI и Sal Gil, длительное культивирование, низкий выход целевого продукта (5000- 6400 ед.акт./г биомассы) и небольшая концентрация последнего (2000 ед.акт./мл).

Целью изобретения является повышение выхода целевого фермента, узнающего и расщепляющего последовательность нуклеотидов GTCGAC.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу в качестве штамма-продуцента эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GTCGAC, используют штамм Rhizoblum trifolii, продуцирующий только одну рестриктазу Rtr I в повышенном количестве, в совокупности с методом очистки фермента путем фракционирования клеточных компонентов в двухфазной системе полиэтиленгликоль-декстран в присутствии 0,7 моль/л NaCI с последующими хроматографиями на фосфоцеллюлозе Р- 11 и гепарин-сефарозе.

Используемый штамм Rhizobium trifolii депонирован а коллекции Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии под номером В-194.

Наличие в штамме только одной рестриктазы с большим ее содержанием на 1 г клеток позволило применить для очистки фермента простой способ, сочетающий такие хорошо себя зарекомендовавшие стадии для очист ки рестриктаз, как фракционирование клеточного экстракта в системе полиэтиленгликоль-декстран и две хроматографии на фосфоцеллюлозе Р-11 и гепарин-сефарозе.

В результате использования предлагаемого способа удается получить 40000 ед.акт, фермента из 1 г влажных клеток (около 12% исходного содержания фермента в грубом

экстракте), что в 6-8 раз больше, чем в известном способе. Полученная рестриктаза характеризуется следующими свойствами: узнает и гидролизует последовательность нуклеотидов GTCGAC; оптимальное значе0 ние рН для действия рестриктазы 8,0; оптимальная температура 37°С; для проявления активности рестриктазы требуются ионы

,2+

Мд/+ (оптимальная концентрация Mgz+ 10- 15 мМ), оптимальная концентрация NaCI в

5 реакционной смеси 100-120 мМ.

Полученный ферментный препарат свободен от значительных количеств неспецифических нуклеаз и фосфатаз. При инкубации 200 ед.акт. фермента с 1 мкгДНК

0 фага в течение 2 ч при 37°С наблюдается стандартный набор фрагментов ДНК. Фрагменты ДНК, полученные при инкубации 10 ед.акт. фермента с 1 мкг ДНК фага в течение 2 ч при 37°С, сшиваются ДНК-лигазой и по5 вторно гидролизуются рестриктазой Rtr I.

Определяющими отличиями предлагаемого способа являются использование в качестве штамма-продуцента Rhizobium trifolii, содержащего только одну рестрикта0 зу, и использование для очистки фермента комбинации методов из фракционирования клеточных компонентов в двухфазной системе полиэтиленгликоль-декстран в присутствии 0,7 моль/л NaCI и хроматографии на

5 фосфоцеллюлозе Р-11 и гепарин-сефарозе, что позволяет в 6-8 раз повысить выход целевого фермента по сравнению с известным способом, дает возможность получать более концентрированный ферментный

0 препарат (50000-80000 вместо 2000 ед.акт./мл в известном способе).

Пример 1. Культивирование штамма Rhizobium trifolii.

Культуру R.trifolii выращивают на пита5 тельном бульоне следующего состава, г/л воды: пептон 10, дрожжевой экстракт 5; хлористый натрий 5; глюкоза 10. Для получения инокулята суточную культуру с плотной среды засевают петлей в две колбы с 50 мл

0 питательного бульона в каждой. Выращивают в течение 24 ч на термостатированной качалке при 28-30°С со скоростью 200-250 об/мин. Затем полученным таким образом инокулятом засевают девять колб с 250 мл

5 питательного бульона в каждой и выращивают культуру в тех же условиях (24 ч при 28-30°С и 200-250 об/мин), Сбор биомассы проводят центрифугированием в течение 20 мин при 5000 об/мин. Конечный выход биомассы 6,0-6,5 ч/л.

Пример 2. Очистка фермента.

2 г клеток суспендируют в 4 мл буфера экстракции, содержащего 0,1 М трис-HCI, рН 8,0,0,1 М NaCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол. 0,1 %-ный тритон Х-100и лизоцимО,1 мг/мл до гомогенного состояния. Смесь инкубируют 30 мин при 0°С в ледяной бане и затем обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН-2 три раза по 20 с с перерывами по 40 с для охлаждения.

К суспензии добавляют 10 мл раствора, содержащего 11,2%-ный полиэтиленгли- коль ПЭГ-6000, 3,2%-ный декстран Т-500 и 1,05 М NaCI (конечные концентрации ингредиентов в суспензионной смеси: полиэти- ленгликоль 7%, декстран 2% и NaCI 0,7 М). Смесь тщательно перемешивают, выдерживают 20 мин при 0°С и затем центрифугируют 15 мин при 5000 об/мин. Супернатант (13,5 мл) собирают и диализуют 3 ч против 400 мл буфера А, содержащего 20 мМ калий- фосфат, рН 7,4,0,1 М NaCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол и 0,1 %-ный тритон Х-100. Отдиализованный раствор наносят на ко- лонку (8 мл) с фосфоцеллюлозой Р-11. Колонку промывают 16 мл буфера А и белки элюируют линейным градиентом NaCI от 0,1 до 1,0 М в буфере А. Рестриктаза Rtr I обычно элюируется с колонки при концентрации NaCI 0,5-0,65 М. Фракции, содержащие активность рестриктазы, объединяют (12-15 мл) и диализуют 3 ч против 400 мл буфера А.

Отдиализованный раствор наносят на колонку (2 мл) с гепарин-сефарозой. Колон- ку промывают 5 мл буфера А и белки элюируют линейным градиентом NaCI от 0,1 до 1,0 М в буфере А Рестриктаза Rtr I обычно элюируется с колонки при концентрации NaCI 0,5-0,7 М. Фракции, содержащие ре- стриктазную активность, объединяют (3-5

мл) и диализуют против 100 мл буфера Б, содержащего 10 мМ трис-HCI, рН 7,4,50 мМ НС, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА и 50%-ный глицерин б течение 16 ч.

Полученный ферментный препарат хранят при -20°С в течение 6-12 мес.

Выход рестриктазы Rtr I из 2г клеток 80000 ± 20000 ед.акт. с концентрацией 80000 ± 20000 ед.акт./мл.

Использование предлагаемого способа по сравнению с известным позволяет повысить в 6-8 раз выход целевого фермента; сократить в 3 раза время культивирования; повысить в 30-50 раз концентрацию фермента в конечном препарате.

Формула изобретения Способ получения рестриктазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GTCGAC, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма в жидкой пи- тательной среде, сбор биомассы центрифугированием, дезинтеграцию клеток ультразвуком и хроматографическую очистку фермента, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Rhlzobli/m trifolii ВНИИСХМ В-194, перед очисткой полученный клеточный дезинтеграт фракционируют в двухфазной системе, содержащей 7%-ный полиэтиленгликоль и 2%-ный декстран, в присутствии 0,7 М NaCI, а хроматографическую очистку ведут последова- тельно на фосфоцеллюлозе Р-11 и гепарин-сефарозе с элюцей раствором NaCI в концентрации 0,5-0,7 М.

Использование: биотехнология, генная инженерия. Сущность изобретения: способ предусматривает использование в качестве штамма продуцета Rhizobium trifolii ВНИ- ИСХМ В-194, содержащего только одну ре- стриктазу, и использование для очистки фермента комбинации методов из фракцио нирования клеточных компонентов в двухфазной системе 7%-ный полиэтиленгликоль - 2%-ный декстран в присутствии 0,7 М NaCI и хроматографии на фосфоцеллюлозе Р-11 и гепарин-сефарозе с элюцией раствором NaCI в концентрации 0,5-0,7 М, что позволяет в 6-8 раз повысить выход целевого фермента и тем самым снизить себестоимость продукции. СО с