Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI-продуцент рестриктазы @ со130 1 Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к выявлению микроорганизма, способного продуцировать рестриктазу, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов СС (A/T)(A/T)GG и разванную, согласно общепринятой номенклатуре, Есо130 I,которая используется для исследования первичной структуры ДНК и в генной инженерии.

Целью изобретения является выявление штамма-продуце.нта Escherichia coli BKIIM B-4498 (RFL-130) рекстрик- тазы, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5... А/Т А/Т GG...3

Штамм Г/scherichia coli 130, продуцирует рестриктазу Есо130 I (изоши- зомер рекстриктазы Sty 1) с высокой продуктивностью, что способствует повышению выхода целевого фермента в 20 раз по сравнению с известным штаммом-продуцентом.

Итамм Escherichia coli RFL 130 получен из Республиканской санитарно- эпидемиологической станции Литовской ССР.

Используемый штамм Escherichia со-, li RFL 130 обладает следующими характеристиками.

Морфолого-культуральные признаки. Клетки палочковидные. В стандартных

жидких средах встречаются по одиночке, в парах или коротких цепочках. Подвижны.На мясопептонном агаре после 24 ч инкубации в термостате при 37°С образует круглые с ровными краями, гладкие, блестящие колонии: величиной 2,0-2,5 мм в диаметре. Колонии с агаром не срастаются, беловатого цвета, В мясопептонном бульоне образуют мутность.

Физиологические признаки. Оптимальная температура роста 37°С. Грам- отрицательные, каталазоположительные; оксидазоотрицательные. Факультативный анаэроб.

Лактозу, сахарозу, глюкозу окисляет. На среде.Симонса не растет. При росте Н S .не выделяет.

Не усваивает мочевину. Усваивает индол.

Клетки подвижные. Культура хранится в пробирках на среде МПА под слоем стерильного вазелинового масла при температуре +4°С и в лиофилизирован- ном виде.

Полученная рекстриктаза Есо130 I характеризуется следующими свойствами: узнает и расщепляет последователь ность нуклеотидов -5 .. .С С (А/Т) (А/Т) GG...3 в молекуле ДНК; оптимальное значение рН для действия рестрикта- эы 8,3-8,7; для проявления активности рестриктазы требуется Mg , оптимальная концентрация 8-12 мМ.

Пример, Получение биомассы Escherichia coli RFL 130.

Для получения биомассы Escherichia coli RFL 130 используют лабораторный ферментер Биолафит (Франция), рН- метр, термостат, круговые качалки, спектрофотометр СФ-26, лабораторную центрифугу типа ЦЕПА (ФРГ), бокс ламинарный, автоклав, дистиллятор.

Для поддержания и культивирования штамма используют две среды. Среда для поддержания штамма 1 представляет собой мясопепто.нный бульон с добавлением до 2% агара. Среда для культиви- рования штамма 2 содержит, г/л: пептон 1; дрожжевой экстракт 5; NaCl 1; рН 7,0-7,2.

Агаризованную среду 1 разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при 0,8 атм в течение 40 мин,. Компоненты жидкой питательной среды 2 стерилизуют при,1,0 атм в течение 20 мин.

Q с

5

5

Штамм Escherichia coli RFL 130

поддерживают в пробирках на среде 1 под слоем вазелинового масла при +4°С и в лиофилизированном виде. Для оживления культуру Escherichia coli RFL 130 пересевают на чашку Петри с ага- ризованной питательной средой 1 и инкубируют при 37°С 18 ч. Оживлен- ; ную культуру еще раз пересевают на наклонный агар со средой 1 и инкубируют при 37°С 18 ч. Затем культуру бактериологической петлей переносят в пробирку с 5 мл стерильного мясо- пептонного бульона и инкубируют в течение 3 ч при 37 С на качалках, делающих 220-250 об/мин. По 0,1 мл полученной суспензии клеток вносят в две колбы с 0,25 л среды 2 в каждой. Инокулят выращивают на термостатированных круговых качалках при 180 - 200 об/мин, 37°С, в течение 18 ч. Оптическая плотность суспензии ино- улята на СЭФ-26 при длине волны 540 нм составляет 6,0 о.е. Полученный инокулят засевают в лабораторный ферментер Виолафит, содержащий Юл среды № 2.

Культуру Escherichia coli RFL 130 выращивают при 37ЙС, рН 7,0, со ско- ростью перемешивания в первый час культивирования 200 об/мин и далее до 400 об/мин, а также подачей сте- риального воздуха 4 л/мин в первый час роста с постепенным увеличением до 7 л/мин на третьем часу роста . Заданный рН во время ферментации поддерживают добавлением в среду 1 М ортофосфорной кислоты. Во время культивирования периодически отбирают пробы и измеряют оптическую плотность суспензии клеток.Культивирование штамма проводят до поздней логарифмической фазы роста - оптическая плотность суспензии клеток составляет 3,7 о.е. (длина волны 540 нм, толщина кювет 0,5 см).

Культуральную жидкость охлаждают до 4-4°С и центрифугируют на проточной центрифуге типа ЦЕПА при 23 - 25,10 об/мин. Полученную биомассу хранят при -20°Г.. Выход сырой биомас- .сы 3,80 г/л культуральной жидкости,

Рестриктазу Есо130 I выделяют из биомассы клеток E.coli RFL 130 путем разрушения, удаления обломков клеток центрифугированием с дальнейшей хроматографической очисткой полученного бесклеточного экстракта.

5

Активность рестриктазы тестируют методом гидролиза ДНК фага лямбда с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в агароз- ном геле. Реакционная смесь для гидролиза содержит 0,01 М трис-НС1, рП 8,5 0,01 MMgCl2; 0,1 MNaCl;0,001 M дитиотрейтол; 100 мкг/мл апьбумина; 2 мкг ДНК в 40 мкл смеси и 1-5 мкл ферментного препарата. Реакцию проводят при 37°С 1 ч. Электрофорез проводят в 0,1 М натрийборатном буфере, рН 8,2, 0,002 ЭДТА в течение 1 при напряжении 100 В. Окрашенные этидий- бромидом (1 мкг/мл) гели просматривают в УФ свете.

За условную единицу активности принимается то количество фермента, которое в оптимальных условия за 1 ч полностью расщепляет 1 мкг ДНК фага лямбда.

Из 1 г биомассы получают 40000 единиц рестриктазы Есо130 I.

Качество препарата рестриктазы Есо130 I определяют методом рестрикция - лигирование - рестрикция. То, что фрагменты ДНК, полученные при обработке ДНК фага лямбда 10-кратным избытком рестриктазы Есо130 I в течение 16 ч,полностью ДНК-лигазой Т4, а лигаты полностью растопляются этой же рестриктазой, указывает на отсутствие неспецифических нуклеаз и фос- фотаз в препарате рестриктазы Есо130 I.

Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой

Есо130 Т.и места ее расщепления.

При визуальном сравнении электрофо- ретических картин распределения рестриктов, полученных в результате действия исследуемого фермента Есо-130 I на ДНК фага лямбда с рестриктоэлектроПредлагаемый штамм позволяет полу чить высокоочищенный препарат рестри тазы Есо130 I и значительно повысить

фореграммой рестриктазы Sty 1, пред .р JL i J4-V- I w л- п j чсг ч i-i i CJi JlwriDl ll

ставленной в каталоге фирмы Био-Лабс, 45 выход цеЛевого фермента - в 20 раз

было обнаружено большое их сходство. по сравнению с известным (40000 ед/г

i

В связи с недоступностью известного препарата проверку идентичности суб-

сырой биомассы рестриктазы Есо130 I по сравнению с 2000 ед/г рестриктазы

стратной специфичности Есо130 I и Sty 50 Sty ПолУч ннь й при использовании

1 проводят методом картирования. С использованием известных рестриктаэ установлено, что единственная точка расщепления Есо130 I на ДНК pBR 322 находится в интервале 1360-1385 п.н. по часовой стрелке от Eco R сайта, что хорошо согласовывается с местопо- локением точки Sty 1 на этой ДНК (1369 п.н.). Также определяют величи-

55

штамма Escherichin coli RFL 130 ферментный препарат отличается высоким качеством и успешно используется в работах по генной инженерии.

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli ВКМ В-4498 .- продуцент рестриктазы ЕС0130 I.

10

20

ft 7606

пы рестриктов ДНК фага лямбда образовавшихся под воздействием исследуемого фермента, и проводят картирова- с ние точек расщепления на этом субстрате .

Таким образом,экспериментально установленные величины фрагментов хороню совпадают с расстоянием между последовательностями 5 ..,СС(А/Т)(А/Т) GG, а также между ними и сайтами использованных в опытах рестриктаз (см. таблицу). Полученные данные подтверждают предположение о том, что рест- риктаза Есо130 I узнает последовательность 5.. .СССА/-Т) (A/T)GG.

Для определения места расщепления, этой последовательности используют ДНК плазмиды pBR 322. Ке расщепляют рестриктазой Есо130 I, метили 5 -концы с помогцью Т4-полинуклеотидкиназы.

Меченую ДНК дополнительно обрабатывают рестриктазой CfT 13 1 и нужный субфрагмент (103 п.н) выделяют после электрофореза в полиакриламидном геле. Для определения места расщепления проводят частичный гидролиз выделенного субфрагмента. Двухмерное разделение полученного гидролизата на ац.е- тилцеллюлозе и гомохроматографией

в тонком слое ДЭАЗ-целлюлозы приводит к фингерпринту, из которого выявлено, что гомологичной последовательностью в участке расщепления является пента- нуклеотид .5...CA/TA/TGG. Следовательно, рестриктаза-Есо130 I расщепляет узнаваемый участок между первым и вторым основанием, образуя фрагменты с 5 выступающими липкими концами 5... А/Т А/Т GG...3.

Результаты исследований даны в таблице.

Предлагаемый штамм позволяет получить высокоочищенный препарат рестриктазы Есо130 I и значительно повысить

JL i J4-V- I w л- п j чсг ч i-i i CJi JlwriDl ll

выход цеЛевого фермента - в 20 раз

сырой биомассы рестриктазы Есо130 I по сравнению с 2000 ед/г рестриктазы

Sty ПолУч ннь й при использовании

штамма Escherichin coli RFL 130 ферментный препарат отличается высоким качеством и успешно используется в работах по генной инженерии.

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli ВКМ В-4498 .- продуцент рестриктазы ЕС0130 I.

П р имечавпе.

- расчетные величины фрагментов, Э - экспериментально установленные величины фрагментов, (-) - фрагменты в геле отсутствую

Изобретение относится к биотехнологии, к выявлению микроорганизма, способного продуцировать сайт-специфическую эндонуклеазу-рестриктазу. Рестриктаза может быть использована для исследования первичной структуры ДНК и в генной инженерии. Культивирование продуцента Kscherichia coli ВКПМ R-4498 (UFL 130 проводят в условиях аэрации при 37°С на питательной среде, содержащей, г/л: пептон 1; дрожжевой экстракт 5; NaCl 10, рН 7,0-7,2 до достижения оптической плотности суспензии клеток 3,0-3,7 о. е. Очистку фермента проводят хромл- тографическим путем. Выход фермента составляет 40000 ед. на 1 г биомассы. 1 табл. Р