РЕКОМБИНАТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PECO29KI, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ СИНТЕЗ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ ECO29KI И ШТАММ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ ECO29KI Российский патент 1996 года по МПК C12N5/22 C12N9/22 C12N1/21 

Изобретение относятся к биотехнологии и представляют собой рекомбинантную плазмидную ДНК, определяющую синтез эндонуклеазы рестрикции Eco29kI и штамм бактерий Escherichia coli, который может быть использован для получения эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-CCGCiGG-3' в составе двухцепочечной ДНК. Рестриктаза Eco29kI, продуцируемая предлагаемым штаммом, является изошизомером известной рестриктазы SacII и может найти применение в генно-инженерных исследованиях, как в экспериментах по конструированию рекомбинантных ДНК in vitro, так и при изучении первичной структуры ДНК.

Известна рестриктаза SacII, продуцируемая штаммом, бактерий Streptomyces achromogenes АТСС 12767, которая узнает и расщепляет участок ДНК 5'-CCgCIGG-3'. Содержание рестриктазы в биомассе не указано.

Известен, также изошизомер рестриктазы SacII, выделенный из штамма Gluconobacter albidus IFO 3262, способ получения которого описан в патенте США 4668631. Выход очищенного фермента составляет 375 ед на 1 г сырой биомассы клеток.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение является получение штамма, продуцирующего рестриктазу заданной специфичности с более высоким выходом, быстро растущего на стандартных питательных средах.

Сущность предлагаемых изобретений состоит в том, что получена рекомбинантная плазмида pECO29kI с генами системы рестрикции-модификации Eco29kI, обуславливающая синтез рестриктазы Eco29kI, и штамм бактерий, содержащий эту рекомбинантную ДНК продуцент рестриктазы Eco29kI.

Полученная рекомбинантная плазмида pECO29kI размером 6,6 т.п.н. кодирующая эндонуклеазу рестрикции Eco29kI, является неконъюгативной, совместимой с мультикопийными плазмидами ColE1-типа, и состоит из следующих элементов: из двух ClaI-фрагментов ДНК природной плазмиды p29k размерами: 1,95 т.п.н. каждый, содержащих гены рестрикции-модификации Eco29kI и ClaI-фрагмента ДНК pUC129 размером 2,7 т.п.н. Плазмида содержит четыре участка узнавания рестриктазой HingIII, расположенных на расстоянии: 0,68 т.п.н. 1,4 т.п.н. 1,75 т.п.н. и 2.8 т.п.н. три участка узнавания для R.ClaI, расположенных на расстоянии 1,95 т.п.н. 1.95 т.п.н. 2,7 т.п.н. два участка узнавания для R.XhoI, расположенных на расстоянии 1,72 т.п.н. 4,9 т.п.н. и по одному участку узнавания рестриктазами SalI, BgIII, BamHI; bla-ген, ответственный за синтез бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость клеток к ампициллину; eco29kIR-ген, кодирующий эндонуклеазу рестрикции Eco29kI, обеспечивающий ограничение фага ⊘ 80 vir; eco29kIM-ген, кодирующий метилазу Eco29kI, обеспечивающий модификацию нуклеотидной последовательности CCGCGC и защиту ДНК от расщепления рестриктазой Eco29kI; ori-репликон плазмиды рМВ1.

Способ конструирования плазмиды заключается в том, что плазмидную ДНК вектора pUC129 гидролизуют эндонуклеазой рестрикции ClaI и соединяют ДНК-лигазой с ДНК природной плазмиды p29k, расщепленной этой же рестриктазой в условиях неполного гидролиза. Смесь соединенных фрагментов трансформируют в клетки Escherichia coli К802, содержащие природную плазмиду p29k. Трансформанты высевают на среду с ампициллином и из выросших клонов выделяют экстрахромосомальную ДНК, которой трансформируют компетентные клетки E.coli К802. Трансформанты отбирают на агаризованной среде, содержащей ампициллин и бактериофаг лямбда vir, и из полученных на этой среде клонов выделяют плазмидную ДНК, обозначенную как pECO29kI.

Предлагаемый штамм-продуцент эндонуклеазы рестрикции Eco29kI получают трансформацией плазмидной ДНК pECO29kI в штамм Escherichia coli Z85. В этом штамме плазмидная ДНК pECO29kI стабильна и обеспечивает повышенный синтез фермента. Содержание рестриктазы Eco29kI в предлагаемом штамме 10 млн единиц/на грамм сырой биомассы клеток.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИВФМ РАН и хранится в ней под номером ВКМ CR-369D.

Штамм Escherichia coli BKM CR-369D имеет следующие характеристики. Культурально-морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, размером 0,7-0,8 мкм в поперечнике и 2-3, иногда 5 мкм, в длину, подвижные, грамотрицательные с латеральными жгутиками. Располагаются одиночно, парами или цепочками, неспороносные.

Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, МПБ, LB-бульон и LB-агар). При росте на мясо-пептонном агаре или LB-агаре колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, мутные. При росте в жидких средах: в МПБ-бульоне или LB-бульоне образуют ровную интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в предела от 4 до 50^оС, оптимальная температура роста 37^оС, оптимум рН 6,8-7,4.

В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности: альфа-глюкозу, альфа-фруктозу, галактозу, арабинозу, лактозу, трегалактозу.

В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот.

Нитраты восстанавливают до нитритов.

Желатину не разжижают.

Индол не образуют.

Генетические признаки: генотип Δ (lac pro), thi, strA, supE, endA, sbcB, hsdR-, F'traD36, proAB, lac1q, ZЛМ15, recA: Tn10. Штамм проявляет устойчивость к ампициллину (50 мкг/мл), обусловленную наличием в составе ДНК pECO29kI гена бета-лактамазы, обеспечивающего устойчивость клеток с плазмидой к ампициллину и тетрациклину (20 мкг/мл), обусловленную наличием в штамме Z85 транспозона Tn10.

Условия хранения штамма:
Штамм бактерий Escherichia coli BKM CR-369D хранят на чашках и косяках. Пересевы на свежие среды один раз в месяц. Может храниться не менее года в 15% глицерине при -20-70^оС, в лиофильно-высушенном состоянии с сахаро-желатиновым агаром или в полужидкой агаризованной среде LB под вазелиновым маслом.

П р и м е р 1. Конструирование плазмиды pECO29kI.

Экстрахромосомольную ДНК, в частности, плазмиду p29k, выделенную из природного штамма E.coli 29k, гдиролизуют рестриктазой ClaI в условиях неполного гидролиза при 37^оС в течение 15 мин в буфере, содержащем 10 мМ трис HCl, pH7,5, 50 мМ NaCl, 10 mM MgC12, 1 mM дитиотреитола. Векторную плазмидную ДНК pUC129 гидролизуют рестриктазой ClaI в течение часа в буфере, указанном выше. Ферменты инактивируют экстракцией ДНК водонасыщенным фенолом и, после переосаждения этанолом, 2 кг ClaI-гидролизата ДНК из E.coli 29k смешивают с 0,2 мкг ClaI-гидролизата pUC129, добавляют АТФ до 5 мМ и проводят реакцию в присутствии 0,1 ед. ДНК-лигазы фага 14 при 10^оС 16 ч в буфере 66 мМ трис-HCl pH 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgC12, 1 мМ дитиотреитола. Лизагу инактивируют прогреванием при 65^оС 10 мин и инкубационную смесь используют для трансформации компетентных клеток E.coli К802, содержащих природную плазмиду p29k.

Из трансформантов, выросших на селективной агаризованной среде с ампициллином (50 мкг/мл), выделяют суммарную экстрахромосомальную ДНК и используют ее для транфсормации клеток E.coli К802. Среди трансформантов, выросших на среде с ампициллином и с бактериофагом лямбда vir в количестве 100 фаговых частиц на бактериальную клетку, отбирают клоны, содержащие систему рестрикции-модификации Eco29kI. Из полученных трансформантов выделяют плазмидную ДНК pECO29kI и проводят рестрикционный анализ с помощью эндонуклеаз рестрикции: HindIII, EcoRI, AvaI, SmaI, ClaI, XhoI, KpnI, SalI с использованием соответствующих буферов для инкубации.

П р и м е р 2. Получение штамма Escherichia coli Z85 (pECO29kI).

Плазмидой pECO29kI трансформируют компетентные клетки E.coli Z85. Среди трансформантов, выросших на среде с ампициллином (50 мкг/мл) и бактериофагом лямбда vir в количестве 100 фаговых частиц на клетку, отбирают клоны, содержащие систему рестрикции-модификации Eco29kI и один из них используют в качестве штамма-продуцента рестриктазы Eco29I.

П р и м е р 3. Получение и очистка рестриктазы.

Культуру клеток E.coli Z85 (pECO29kI) выращивают в 1 л LB-бульона (5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 10 г бактотриптон на 1 л воды) при 37 град С до титра 2х10⁹ кл/мл. Клетки осаждают центрифугированием (6000 об/мин 15 мин), 1 г сырой биомассы суспендируют в 5 мл буфера, содержащего 10 мМ трис HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола. Клетки разрушают ультразвуком, полученный экстракт центрифугируют при 48000 g при 2^оС.

Для определения активности рестриктазы Eco29kI готовят серийные разведения супернатанта: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 в буфере (10 мМ трис HCl рН 7,5, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанол). В инкубационную смесь (9 мкл), содержащую 10 мМ трис HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 75 мМ KCl, 10 мМ MgC12, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ ДТЕ, 1 мкг ДНК фага лямбда, добавляют 1 мкл соответствующего разведения экстракта и инкубируют при 37 град. С в течение 1 ч. Результаты гидролиза проверяют с помощью электрофореза в 1,2% агарозном геле. За единицу активности берут количество фермента, необходимое для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч.

Уровень активности рекстриктазы Eco29kI, определенный в бесклеточном экстракте штамма E.coli Z85 (pECO29kI), около 10000000 ед в пересчете на 1 г сырой биомассы.

Рестриктаза Eco29kI может быть очищена фракционированием клеточного экстракта последовательно на колонках с DEAE-целлюлозой (DE-Б2 Whatman) с последующей хроматографией на фосфоцеллюлозе (Р11, Whatman), гидроксилапатите и гепарин-агарозе при фракционировании сульфатом аммония после хроматографии на фосфоцеллюлозе. Препарат фермента окончательно концентрируют при диализе против 50% глицерина. Выход очищенного фермента составляет 500000 ед/г биомассы клеток.

Очищенный фермент стабилен при -20^оС в течение полугода. При 20^оС рестриктаза Eco29kI сохраняет 95% своей активности в течение 14 дней, при 37^оС 50% в течение 14 дней, при 65^оС 95% в течение 60 мин. Рестриктаза пригодна для анализа структуры ДНК и для молекулярного клонирования.

П р и м е р 4. Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Eco29kI и места гидролиза ДНК.

Для определения последовательности узнавания рестриктазы проводят сравнение величин длин фрагментов, полученных экспериментально при гидролизе ДНК фага лямбда рестриктазой Eco29kI с величинами длин фрагментов, рассчитанных на ЭВМ по соответствующим программам для различных последовательностей нуклеотидов. Была обнаружена только одна последовательность 5'-CCGC!GG-3', для которой рассчитанные величины фрагментов совпадали с экспериментальными и были локализованы в следующих районах первичной нуклеотидной последовательности ДНК фага лямбда (п.н.): 20323, 20533, 21609, 40389.

Для подтверждения полученных данных проводят картирование участков узнавания рестриктазой Eco29kI на ДНК фага лямбда, используя совместный гидролиз с рестриктазой NruI.

Для определения места гидролиза ДНК рестриктазой Eco29kI используют ДНК pUC128. После отжига с синтетическим праймером (17-mer) и реакцией полимеризации матрицу обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Eco29kI. Часть пробы вторично подвергают полимеризации и оба полученных препарата исследуют в условиях, предложенных Simcon с соавторами. Четыре стандартные секвенирующие реакции проводят согласно протоколу Sanger с соавторами.

Проведенные опыты позволяют сделать однозначный вывод, что рестриктаза Eco29kI является истинным изошизомером рестриктазы SacII и узнает последовательность нуклеотидов
5'-CCGC!GG-3'
Кроме того, полученная рестриктаза Eco29kI характеризуется следующими оптимальными условиями реакции:
оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,2-8,5
оптимальная температура действия 37^оС.

NaCl 20-120 мМ
Таким образом, получена рекомбинантная плазмида pECO29kI, содержащая гены системы рестрикции-модификации Eco29kI. Данная плазмида обеспечивает высокий уровень синтеза эндонуклеазы рестрикции Eco29kI.

Предлагаемый штамм E.coli BKM CR-369D, как продуцент специфической эндонуклеазы Eco29kI, обеспечивает высокий уровень содержания фермента, не менее 10000000 ед на 1 г сырого вещества биомассы клеток, что достаточно для получения рестриктазы в препаративных количествах. Выход очищенного фермента составляет не менее 500000 ед/г биомассы клеток, что в 1300 раз выше, чем в случае прототипа.

Использование: полученные плазмида и штамм могут быть использованы для получения эндонуклеазы рестрикции Eco 29KI, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5′-CCGCGG-3′, которая может найти применение в генно - инженерных исследованиях. Рестриктаза Eco 29 KI является изошизомером рестриктазы Sac II. Сущность изобретения: полученная новая рекомбинантная плазмида PECO 29 KI размером 6,6 т. п. н. содержит гены системы рестрикции - модификации Eco 29 KI, состоит из Cla I - фрагмента ДНК вектора PUC 129 и двух Cla I - фрагментов природной плазмиды p 29к, содержит четыре участка узнавания рестриктазой Hind III три участка узнавания рестриктазой, два участка - Xho I, по одному участку для рестриктаз: Sal I, Bgl II, Bam H I, детерминанту резистентности к ампициллину. Полученная плазмида обеспечивает повышенный синтез рестриктазы Eco 29 KI. Предлагаемый штамм Escherichia coli BKM CR - 369 D полученный трансформацией плазмидной ДНК pEco 29 KI в штамм E. coli Z 85 обеспечивает высокий уровень содержания фермента, не менее 100 млм ед. на 1 г сырой биомассы. Выход очищенного фермента составляет 500000 ед/г биомассы. 2 с. п. ф-лы

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pEco29kI - определяющая синтез эндонуклеазы рестрикции Eco29kI размером 6,6 т.п.н, содержащая два ClaI-фрагмента ДНК природной плазмиды p29k размером 1,95 т.п.н каждый, геном системы рестрикции - модификации Eco29kI; ClaI-фрагмент ДНК вектора puC129 размером 2,7 т. п. н; сайты рестрикции: четыре участка узнавания рестриктазой Hind III, расположенных на расстоянии 0,68; 1,4; 1,75 и 2,8 т.п.н; три участка узнавания для рестриктазы ClaI; - два участка узнавания для рестриктазы XhoI, расположенных на расстоянии 1,72 и 4,9 т.п.н.; - уникальные участки узнавания для рестриктаз: Sal I, Bgl II, Bam H I; - генетические маркеры: - bla-ген, ответственный за синтез бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость клеток к ампициллину, eco29kIR-ген, кодирующий эндонуклеазу рестрикции Eco29kI, обеспечивающий ограничение фага диаметром 80 vir; - eco29kIM-ген, кодирующий метилазу Eco29kI, обеспечивающий модификацию нуклеотидной последовательности CCSGG и защиту ДНК от расщепления рестриктазой Eco29kI; - ori-реклипкон плазмиды pMBI. 2. Штамм бактерий Escherichia coli ВКМ CR-369D - продуцент эндонуклеазы рестрикции Eco29kI.