Способ получения фосфолипазы @ Советский патент 1984 года по МПК C12N9/16 

выделения биологически активных сое динений из природных источников, а именно к способам получения липолитического фермента-фосфолипазы А (фосфатид-1-ацилгидролазы КФ 3.1,1. Известен способ получения фосфол пазы А Ecsherichia coli lj. Однако при этом очищенный фермент наряду с фосфолипазной активностью обладает высокой лизофосфоли пазной активностью. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаем му положительному эффекту является способ получения фосфолипазы А, вк чающий гомогенизирование животной ткани (поджелудочной .железы быка), подкисление экстракта до рН 5,0, осаждение целевого продукта сульфатом аммония и хроматографическую очистку обычно на карбоксиметшщеллюлозе Tzj . Недостатками известного способа являются загрязнениецелевого продукта лизофосфолипазой, а также мно гостадийность и д.пительность процес са вьщеления. Целью изобретения является получение продукта, свободного от приме сей лизофосфолипазы. Поставленная цель достигается те что согласно способу получения фосфолипазы A|,j включаняцему гомогени;зирование животной ткани, экстракци |подкисление экстракта до рН 5,0, осаждение целевого продукта сульфатом аммония и хроматографическую очистк в качестве животной ткани используют кишечник Urechis unicinctus, а экстракт перед подкислением подверг ют термообработке при 45-55°С в течение 5-10 мин. Предпочтительно хроматографическую очистку проводят на диэтиламино этилцеллюлозе и карбоксиметилцеллюлозе. В качестве животной ткани используется кишечник Urechis unicinctus, встречающийся в морях Дальнего Востока и являняцийся доступным сырьем, Благодаря использованию термообработ ки гомогената достигается инактивация протеиназ, выпадение в осадок балластных белков и повышение удельной активности целевого продукта. Нагревание необходимо проводить при температуре 45-55 С в течение 5-10 мин. все балластные белки вьшадают в осадок , а повьшение температуры приводит к инактивации фермента. Это же относится и к интервалу времени. Пример. Для получения фосфолипазы А| предлагаемым способом берут кишечник от трех животных (100 г), гомогенизируют в трех, объемах 0,05 М трис -HCf буфера и центрифугируют при 1 бОООл- в течение 30 мин, осадок отбрасывают, супернатант прогревают при 50 С 5 мин, оставляют в холодильнике на несколько часов и центрифугируют при 6000f 30 мин. Осадок отбрасывают, супернатант при энергичном помешивании доводят 4N НС до рН 5,0,, оставляют на 2 ч в холодильнике и центрифугируют. рН супернанта доводят кристаллическим оксиметил-аминометаном (трис) до рН 7,5. К супернатанту добавляют твердого сульфата аммония до 0,4 насыщения и оставляют на ночь в холодильнике. После центрифугирования осадок растворяют в 5 мл 0,05 М тр«с -HCf буфера рН 7,5. После дийлиза раствор фермента наносят на колонку ДЕАЕ-целлюлозой. Размеры колонки: длина 15см, диаметр 2,5 см, злюция сначала 0,05М ttmc-HCE буфером, затем ступенчатым градиентом 0,03 М NaCl в том же буфере, скорость элюции 36 мл/ч, объем собираемых фракций 5 мл. Определение фосфолипазной активности проведено инкубацией субстрата 14С-фЬсфатидилхолина с исследуемым ферментным препаратом непосредственно на тонкослойной пластине с S i02 над влажной камерой в течение 30 мин, последующим высушиванием пластинки при 70°С в течение 5 мин, разделением хроматограг1мы в системе хлороформ-метанол-аммиак (65-35-5) и обнаружением продуктов реакции парами иода. Количественное определение активности проводят, замеряя НС-активность продуктов реакции на спектрометре Sutertechniqufi SL-30. Белковые фракции с максимальной фосфолипазной активностью объединяют и отдиадизовьгоают против 0,02 М ацетатного буфера рН 5,6. Белок в иализате концентрируют добавкой сухого акрилекса Р-2 с последунщим отделением набухшего акрилекса центрифугированием при 3000 в течение 10 мин. Раствор 48 мг фермента в 5 мл 0,02 М ацетатного буфера рН 5,6 загружают на колонку КМ-целлхшо ы (длина 10 см, диаметр 2,5 см, скорость элюции 30 мл/ч, элюция 0,02 М ацетатным буфером рН 5,6-, затем ступенчатым градиентом 0-0, 3 М NaCl в том же буферу. Активный пик фермен та собирают и концентрируют акрипексом как описано выше. Все процедуры по очистке фермента на колонках проводят при температуре .6°С. Использование предлагаемого способа позволяет выделить фосфолипазу А( , очищенную в 39 раз по сравнению с исходным гомогенатом,и получить фермент, обладающий только фосф липазной А| активностью без примеся лизофосфолштазы. Предлагдепв1й сяоеев обеспечивает тюктхвацйо , выпадение в осадок балластмлс белков и повышение удельной активности фос- фолипазы А благодаря использованию на первой стадю очиетки npoiqpeeltкия гомогената пря в 5 мин. . Применение нового внда сырья позволяет получать фосфол1шазу А. как биохимический препарат для науч«1ых i целей при исследовании (теологических мембран и в синтезе фосфолюридов и их производных.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗЫ А,, включающий гомогенизирование животной ткани, экстрацию, под кисление экстракта до рН 5,0, осаждение целевого продукта сульфатом аммония и хроматографическую очистку, отличающийся- тем, что, с целью получения продукта, свободного от прго1есей лиэофосфолипаэы, в качестве животной ткани используют кишечник Urechis unicinctus, а экстракт перед подкислением подвергают термообработке при 45-55 С в течение 5-10 мин. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что хроматографическую очистку проводят на диэтиламиноСП этилцеллюлозе и карбоксиметилцеллюлозе.

Схема очистки фосфолипазы А| из кишечника Urechis unicinctus

- фосфатидилхолин

Таблица 1

j11055026

Лизофосфолипазная активность препаратов при выделении фосфолипаэы Aj

Стадия очистки Исходный гомогенат 8 ТПрогревание при 81 Подкисление до рН 5,0 82 Осаждение (N114)804 81 ДЕАЕ-целлюлоза- I пик . 12

I

КМ-целлкшоза

Определение негидролизовавшегося лизофосфатндилхолина. в мкг фосфора (лизоФХ - лизофо(;фатвдилхоли).

Таблица .2

Определение с 2-ацилизо ФХ,

%гидролиза