Способ получения фосфопротеинфосфатазы Советский патент 1985 года по МПК A61K38/45 C12N9/00 

1 Изобретение относится к биохимии, в частности к способам извлечения ферментов (энзимов),и может быть использовано для получения препаративного средства в клинической и экспег риментальной медицине,а также в фармакологической промышленности. Целью изобретения является увелич ние выхода целевого продукта и сокра щение времени его получения. Способ осуществляют следующим образом. Выделяют ядра клеток, фосфопротеинфосфатазу экстрагируют солевыми растворами, диализуют и фракционирую на различных носителях. В качестве экстратирующего агента используют 0,4 М Na-ацетатный буфер рН 5,8. На чертеже отражена зависимость величины экстракции фосфопротеинфосфатазы и балластных белков от ионной силы и солевого состава экстрагирующего раствора. На левой оси ординат отложены величины фосфопротеинфосфатазной актив ности (%), на правой - содержание белка (мг/мл); по оси абсцисс - молярность используемых экстрагирующих растворов. Кроме того, представлены данные об экстракции из ядер клеток селезенки фосфопротеинфосфатазы (кривые 1,111) и белка (кривые II, 1У) при использовании Na-ацетатного буфера разной молярности (кривые,, II) или 0,2 М Na-ацетатного буфера с добавлением хлористого натрия (кри вые III,1У). Использование 0,4 М Na-ацетатного буфера рН 5,8 позволяет избирательно экстрагировать узкую фракцию белков, в том,числе и фосфопротеинфосфатазу и одновременно снижает выход балластных белков, извлечение которых значительно возрастает при добавлении хлористого натрия. Кроме того, исключение NaCl из экстрагирующего раствора позволяет далее проводить работу с экстрактом без дополнительного удаления соли длительным диализом. Для очистки фосфопротеинфосфатазы используют афинные сорбенты - фосфоцеллюлоза и конканавалин-А-сефароза 4В. Пример, Свежезамороженная селезенка быка (2,5 кг), сохраняемая гфи , размораживалась при комнатной температуре. Выделяли ядра клеток. Осадок ядер (600 мл) промы782вали перед экстракцией 0,2 М Na-ацетатным буфером рН 5,8. Все процедуры выделения ядер и фосфопротеинфосфатазы проводили при . Осадок ядер гомогенизировали в растворе 0,4 М Na-ацетатного буфера рН 5,8 в размельчителе тканей РТ-1 в течение 15 мин при 8000 об/мин; соотнощение осадка ядер и раствора 1:5. Гомогенат ядер оставляли на 12-14 ч в холодильнике и затем центрифугировали в течение 30 мин при 2500 G. полного извлечения фермента из ядер экстракцию проводили 3-5 раз. Экстракты объединятш и разводили дистиллированной водой до конечной концентрации Na-ацетатного буфера рН 5,8 - 0,3 М. К разведенному экстракту добавляли фосфоцеллюлозу (200 мл) в li - форме. Смесь тщательно перемешивали и оставляли на 30 мин. После отстаивания насадочная жидкость сливалась, фосфоцеллюлозу промывали 3 раза 5 л 0,3 М Na-ацетатного буфера рН 5,8 и помещали в хроматографическую колонку (4x17 см). Колонку промывали 0,3 М Na-ацетатным буфером рН 5,8 (2л) до полного удаления несвязавшегося белка. Фосфопротеинфосфатазу элюироJвaли 1 М Na-ацетатным буфером рН 5,8. . Элюат (500 мл) диализовали против дистиллированной воды до конечной концентрации Na-ацетатного буфера рН 5,80,2 М.Диализат центрифугировали в течение 30 мин при 2500 G,осадок отбрасывали. Затем проводили повторную хроматографию фосфопротеинфосфатазы на фосфоцеллюлозной колонке (1,6x25 см). Условия сорбции, промывки и элюции фермента аналогичны первой хроматографии на.фосфоцеллюлозе. Элюат (40 мл) после повторной хроматографии на фосфоцеллюлозе фракционировали на сефадексе G -75 (размер колонки 3,5х 80 см), уравновешенном 0,3 М Na-ацетатным буфером рН 5,8, Фосфопротеинфосфатазу выделяли с объемом элюции 365 мл. Фермент после гель-хроматографии подвергали дальнейшей очистке методом аффинной хроматографии на конканавалин-А-сефарозе 4В (размер колонки 1,5 х 4 см), уравновешенной 0,3 М Na-ацетатным буфером рН 5,8. Колонку промывали этим же буфером (300 мл), Фосфопротеинфосфатазу элюировали раствором 0,5 М маннозида в 0,3 М Na-ацетатном буфере рН 5,8 (15 мл конечного продук311820784

та). Препарат сохраняет активность ампулах при . Постадинная харакболее 2 лет при хранении в запаянных теристика способа сведена в табл. 1. I.

Т а 0 л и ц а 1

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОПРОТЕИНФОСФАТАЗЫ, включающий экстракцию солевыми растворами тканей животного происхождения, диализ и фракционирование, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и сокращения времени его получения,экстракцию проводят 0,4 М натрий-ацетатным буфером, ,рН 5,8,а фракционирование осуществля1ют на фосфоцеллюлозе и конкакавалинА-сефарозе 4В. СоОержанив белка ме/мл f,O М

11000,0 345,0

53,0

14,0

1,2 оИз табл. 1 видно, что из 2,5 кг селезенки быка удается вьщелить 1,2 мг очищенного продукта. Выделенный препарат фосфопротеинфосфатазы очищен в 1.663 раза и обладает удельной активностью 1330 ед.

Выход фермента после конечного этапа очистки составлял 14%. Электрофорез проводят в трубках 0,6x10,5 см в течение 3 ч при силе тока 5 мА на трубку. Местоположение фосфопротеинфосфатазы выявляют по образованию окрашенного комплекса о -нафтола с прочным синим Б. Для зтого гели инкубируют в 0,1 М цитратном буфере рН 5,8, содержащем 0,15 мг/мл проч,ного синего Б и 0,5 мг/мп о - нафКоличество зтапов очистки

Выход конечного продукта (0)

100 55

1250 0,8

1 23 6225 18,0

3150 59,0

74

29 21 14 214

2400

171,0 1663

1596 1330,0

тилфосфата в течение 30 мин при . Белки в гелях окрашивают раствором, содержащим 0,1% Кумасси бриллиантового голубого G - 250, 7% уксусной кислоты и 25% изопропанола, в течение 1-4 ч.Гомогенность конечного продукта выявляют методом двойной иммунодифФузии.

Мол. масса фосфопротеинфосфатазы определенная методом диск-электро|фореза в нативных условиях и .методом гель-хроматографии на сефадексе. G -75, составляет 33500 дальток.

Для наглядности эффективности предлагаемого метода по сравнению с известным (12) в табл. 2 представлены некоторые характеристики конечного продукта. Таблица2

11

1663

Индивидуальный белок

0,090

(субстрат фосфоказеин)

33500

20 %

5,8-6,0

(субстрат фосфоказеина)

Ингибиторы

Активаторы

Технико-экономическая эффективность способа получения фосфопротеинфосфатазы по сравнению с известным заключается в значительном увеличении выхода конечного продукта (3-4 раза), упрощение процесса за счет сокращения числа этапов с 11 до 4 (из процесса исключены фракционирование

845

Индивидуальный белок

0,121 (субстрат Р-ги-jTOH Н)

ЗАООО

Не определяли

7,0

(субстрат фосфо4)орилаза а)

N - Этилмалеинимид п-Хпормеркурибензоат Фторид натрия

Аскорбиновая кислота

2-Меркантоэтанол

Дитиотреитол

осаждением сернокислым аммонием, этиловым спиртом и ряд стадий ионообменной хроматографии, многочасовые диализы перед этапами ионообменной хроматографии) и сокращения времени процедуры вьщеления, что особенно важно для выделения нативныхбиологически активных препаратов ферментов.