Способ выявления чумного микроба Советский патент 1992 года по МПК C12N1/00 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в частности для ускоренной идентификации возбудителя чумы в экспедиционных и стационарных условиях.

Известны способы изучения прямого действия бактериофага на плотных и в жидких питательных средах.

Наиболее близким по технической сущности является ускоренный способ, включающий использование приема смешивания исследуемого материала с чумным бактериофагом, контакт чумного бактериофага с культурой микроба на пластинке питательного агара при 28°С с последующей микроскопией. Появление негативных колоний бактериофага свидетельствует о наличии в исследуемом материале возбудителя чумы.

Однако известный способ имеет следующие недостатки: результат учитывается, начиная с 5 до 12 ч, действие чумного бактериофага недостаточно специфично, он может лизировать и штаммы возбудителей псевдотуберкулеза, дизентерии, сельмо- неллеза, а также кишечную палочку.

Цель изобретения является ускорение и повышение специфичности способа.

Указанная цель достигается тем. что согласно способу, включающему контакт чумного бактериофага с возбудителем чумы, каплю смеси из суспензии агаровой культуры с цельным диагностическим фагом наносят на пластинку питательного агара, посев подращивают при 28°С в течение 4 ч, делают мазок-отпечаток с последующей микроскопией.

Существенность отличий предлагаемого способа заключается в том, ч го осуществлен новый подход к учету феномена фаголизабельности. Исследователь получает возможность наблюдать действие фага на микробную клетку непосредственно, а не судить о ней косвенно по отсутствию роста на питательном агаре.

Способ осуществляют следующим образом.

Готовят суспензию изучаемого штамма из односуточной агаровой культуры концентрацией 109 м.к./мл в обьеме 3 мл, добавляют 0,1 мл коммерческого диагностического

(Л

С

ч ел о

00

ь

VI

чумного бактериофага и хорошо перемешивают. Каплю полученной смеси наносят в центр пластинки питательного агара, подсушивают, инкубируют посев при 28°С в течение 4 ч. Делают мазок-отпечаток, фиксируют, окрашивают одномоментно фуксином, кристаллвиолетом или метиленовой синью и просматривают под микроскопом. С контролем проделывают те же манипуляции за исключением добавления бактериофага.

При действии фага в мазках регистрируют клеточный детрит и единичные клетки фагоустойчивых мутантов чумного микроба, увеличенные в размерах вследствие феномена физиологического гигантизма, что свидетельствует об их жизнеспособности. При отсутствии лизиса в опыте и контроле наблюдают одинаковую картину - сотни клеток в поле зрения.

Пример 1.КЗмл одномиллиардовой суспензии чумного вакцинного штамма ЕВ добавляют 0,1 мл чумного диагностического фага, каплю смеси наносят на поверхность агара и после четырехчасовой инкубации при 28оС делают мазок-отпечаток с места посева. Контроль - то же самое, но без контакта с фагом. При просмотре окрашенных мазков-отпечатков с опытной взвеси обнаруживают клеточный детрит, от 1 до 5 крупных клеток не в каждом из 20 просмотренных полей зрения: в контрольной взвеси - в каждом поле зрения сотни крупных клеток, что свидетельствует о действии фага на изучаемую культуру.

Пример 2. Способ осуществлен с штаммом Y pseudotuberculosis21/250. который лизируется чумным диагностическим бактериофагом в прототипном варианте. В результате в опытном мазке-отпечатке, как и в контрольном, регистрируют множество увеличенных а размерах микробных клеток до сотен в поле зрения, что указывает на отсутствие действия фага на культуру псевдотуберкулезного микроба.

Всего испытано 129 штаммов чумного микроба, выделенных от млекопитающих и эктопаразитов в различных очагах Советского Союза и МНР. Штаммы относились к различным подвидам, что свидетельствовало о разнообразии их биологических свойств, включая плазмидный состав. Испытывались также субкультуры отдельеных штаммов, отличающиеся от исходных по кальцийзависимости и пигменетсорбции. Для проверки стабильности результатов 11 штаммов исследовали по З-б раз. Всего

проведено 160 испытаний штаммов возб дителя чумы и его субкультур с использова нием предлагаемого и известною способов Во всех случаях получали однозначные ре

зультэты.

Для подтвереждения специфичность предлагамого способа изучали 43 штамма возбудителя псевдотуберкулеза (включая 15 штаммов, которые в момент выделения лизировались чумным фагом по известному способу). 16 штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза, 10- шигелл, 8- сальмонелл, 5- кишечной палочм Результаты представлены в таблице.

Как видно из таблицы, специфичность предлагаемого способа высока. На штаммы возбудителей кишечного иерсиниоза, шигелл, сальмонелл и кишечной палочки, чумной фаг по предлагаемому и известному

способам не действовали. Преимуществ предлагаемого способа выявлены для штаммов псевдотуберкулезного микроба. Если по известному способу некоторые культуры лизировались чумным фагам, то предлагаемый способ ни в одном случае не выявил это неспецифическое действие.

Особенностью способа является возможность судить о чувствительности к бактериофагу непосредственно по микроскопической картине в мазке-отпечатке: клеточный детрит и единичные жизнеспособные клетки чумного микроба после контакта с фагом, в контроле - сотни неповрежденных микробных клеток в поле

зрения.

Способ можно использовать для уско- рененой идентификации чумного микроба: он позволяет ускорить определение фаголи- забельности с 5-12 до 4 ч, выявляя строго

специфическое действие чумного диагностического фага исключительно на культуры чумного микроба.

Формула изобретения Способ выявления чумного микроба, включающий совместное инкубирование исследуемой культуры и чумного бактериофага на агаровой пластинке с последующим учетом результатов микроскопированмем, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности способа, перед нанесением на агаровую пластинку исследуемую культуру смешивают с чумным бак- териофагом, после инкубации для микроскопирования готовят мазки-отпечатки, окрашивают их и чумной микроб выявляют по наличию в мазках клеточного детрита.

Использование: медицинская микробиология. Сущность изобретения: выявление чумного микроба проводят путем контакта чумного бактериофага с возбудителем чумы, смешивая каплю из суспензии исследуемой агаровой культуры с цельным диагностическим фагом перед нанесением на агаровую пластинку. После совместного инкубирования на агаровой пластинке при 28°С в течение 4 ч делают мазок-отпечаток, окрашивают его и чумной микроб выявляют по наличию в мазках клеточного детрита. 1 табл.