Штамм @ -59-продуцент гидролазы @ - @ -амино- @ -капролактама и @ -лизинамида Советский патент 1984 года по МПК C12N15/00 

О5 00 СО СЛ Изобретение относится к микробиол гической промышленности, в частности к получению нового штамма - продуцен та гидролазы Ь-с/-амино-Е-капролактама и L-лизинамида, который может быт использован для получения L-лизина. Известна способность дрожжей продуцировать гидролитические ферменты .-. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительно му эффекту к предлагаемому является штамм Cryptococcus laurentii IFO 090 2, Однако известный штамм гидролизуе до L-лизина только L-ei-амино-Б-капро пактам. Целью изобретения является получе ние нового штамма - продуцента не только L -о1-амино- -капролактамазы, но и L -лизинамидазы с высокой актив ностью. Поставленная цель достигается с помощью штамма Cryptococcus sp.-59 продуцента гидролазы L-c -амино-Е-капролактама и L-лизинамида, выделе ного из почвы, отобранного на территории Литовской ССР и идентифицированного в лаборатории генетики и селекции промьшшенных микроорганизмов ВНИИ прикладной энзимологии. Новьй штамм хранится в Центральном музее промьшитенных микроорганизмов ВНИИгенетика под номером ЦМПМ У-359. Морфологические признаки штамма Cryptococcus sp.-59: клетки овальные при -выращивании глубинным способом -образует псевдомицелий. Размер отдельных клеток 3-5x6-12 мкм. Образуе колонии складчатой формы белого цвета, край колонии волнистый, поверхность блестящая, профиль выпуклый, диаметр колонии 5-7 мм (.после двухсуточной инкубации). Физиологические свойства штамма Cryptococcus sp.-59: рост на мясопеп тонном агаре умеренный, на питательном агаре - обильный, мясопептонную желатину не разжижает, молоко не свертывает, крахмалоподобные соедине ния не образует, нитраты ассимилируе При 37°С растет слабо, оптимальная темпетатура . В качестве источни ка углерода для роста усваивает глюкозу, лактозу, галактозу, сахарозу, ксилозу, рамнозу, глицерин, этанол. Растет на средах, содержащих, в качестве единственного источника азота и-с/-амино-Е-капролактам, и не растет на средах с Р-ci-амино-Е-капролактамом, В качестве индуктора биосинтеза L-я-амино-Е-капролактамазы и L-лизинамидазы использует Ь-с/-амино- -капролактам или Ц-лизинамид. Культура может храниться в лиофилизированном состоянии. Пример. Для оживленияштамм Cryptococcus sp.-59 засевают на агаризованную среду следующего состава, г/л: глюкоза 20; L-Ы-амино-Е-капролактам гидрохлорид 10; нитрат аммония 5; калий фосфорнокислый однозамещенный 1; магний сернокислый .0,5; марганец хлористый 0,2; дрожжевой экстракт 0,7; рН среды 7,0 (доводят с 10%-ным едким натром), температура культивирования . Двухсуточную культуру употребляют для получения инокулятора, который выращивают в течение 18ч в колбах на качалке (200 об/мин) при 30°С на среде описанного вьш1е состава, но с содержанием 1 о змино- -капролактама гидрохлорида 5 г/л. Среду того же состава употребляют и для глубинного выращивания биомассы продуцента в колбах и в ферментере. Вносимое количество инокулята 3-5% от объема среды. Культивирование в колбах проводят в сосудах объемом 750 мл с 100 мл среды на качалке с 200 об/мин, а культивирование в ферментере типа Виолафит-20 с рабочим объемом 10 л при аэрации 8 л/мин и перемешивании 300 об/мин. На 18-ом часу роста ю1етки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 4000 g, промывают дважды водой и высушивают П5тем лиофилизации. L -oi-Амино-б-капролактамазную активность определяют по скорости образования лизина, измеряемого методом М. Patthy (А. Patthy, Acta Biochira, Blophys. Acad. Sci. Hung., 1975, vol-. 10, ff 4, p. 277). В плотно закрываемую пробирку с микромешалкой и точно взвешенным количеством (обычно 0,01 г) сухих клеток добавляют 1,0мп 0,1 М раствора L-ot-амино-Е-капролактама (рН 8,00) и инкубируют при 50°С. tj (обычно В моменты времени t и после 10 и 50 мин от начала инкубирования) отбирают пробы по 10 мкл и их наносят на хроматографическую бумагу ля высушивания. Для определения образовавшегося в ходе ферментативной реакции лизина, зоны вырезаи1т, пере311068

Носят в пробирки с 1,0 MJI фурфуроль- ного реагента (9%-ный раствор фурфурола в смеси ледяной уксусной кислоты и изопропанола 8:3 с добавлением 1 мг/мл пиросульфита калия) и нагре- 5 вают при 95°С 30 мин. К красноокрашенному раствору добавляют 3,0 мл холодной воды и измеряют оптическую плотность при длине волны 535 нм на спектрофотометре СФ-26. L,-о(1-Амино-6- 10 -капролактамазную активность вычисляют по формуле

UD-ajlOOO

(. А г- активность,Е/г (мкмоль мин-гО ; а - разбавление реакционной пробы (в условиях описанной методики равно 400);

дО - изменение оптической плотности20 анализируемых растворов, взятых в период времени i j Е - молярный коэффициент экстинкции продукта реакции фурфурола с лизином, численно равньй 25 11650 M-см ;

с - концентрация клеток в инкубационной среде, г/мл. L-Лизинамидазную активность клеток определяют по скорости образова- зо ния аммиака, измеряемого ионселективным электродом типа ЭСЛ-91-07 при помощи иономера И-120. Калибровку электрода осуществляют измерением потенциа ла V относительно хлорсеребрянЬго . , электрода известных (0,1-0,0001 М) концентраций хлористого аммония при рН 8,0 и температуре 50 С. Калибровочную прямую получают в виде а + bV. Для определения ферментатив- Q ной активности в пробирке с магнитной мешалкой инкубировали точно взвешенное количество клеток (обычно 0,02 г) с 4,0 мл 0,1 М раствора U -лизинамида (рН 8,0) при 50°С. В пробирку 45

354

помещают ионселективный аммониевый электрод и электрод сравнения и измеряют потенциал электрода в моменты времени Ц и t (обычно 10 и 40 мин от начала инкубгфования). L -Лизинамидазную активность вычисляют по формуле

(,о- .-bv.

S,o

- 10

А - --.

га -л t V

где А - активность, Е/г; V, V - потенциал электрода в моменты времени Ц и t., мВ; а, b - коэффициенты калибровочной

кривой (в условиях определения равные - 0,20 и - 0,26 соответственно);

dt - t - t ,мин; m - масса сухих клеток, г; V - объем инкубационного раствора, мл.

В таблице приведены данные о гидролитической активности нового штамма Cryptococcus sp.-59 и прототипа Сгурtococcus laurentii IFO 0906.

Из приведенных данных видно, что предлагаемый штамм Cryptococcus sp.-5 гидролизует не только L-oi-амино-Е- . -капролактам, но и Ц-лиэинамид, кроме того он способен более эффективно гидролизовать L-oL-амино-Е-капролактам: при культивировании в колбах ферментативная активность на 42%, а при выращивании в ферментере - на 58% выше известного штамма.

Данные штамма Cryptococcus sp.-59 позволяют его применить в производстве лизина; введение стадии ферментативного стереоселективного гидролиза в химический процесс получения этой аминокислоты из смеси DL-ct-амино-Е-капролактама и DL-лизинамида может уменьшить себестоимость продукта.

Cryptococcus laurentii IFO 0906

В колбах

322

Штамм Cryptococcus sp.-59 (коллекция Центрального музея музея промышленных микроорганизмов ВНИИгенетика, коллекционный номер ЦМПМ У-359) продуцент гидролазы L-o -амино-Е-капролактама и L-лизинамида.

Значение получено пересчетом активности известного штамма в единице Е/г.