Способ получения @ -лизина Советский патент 1985 года по МПК C12P13/08 C12P39/00 

(Л

с

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-лизина путем глубинного культивирования его продуцентов на питательной среде, содержащей мелассу в качестве источника углерода, гидролизат белково-витаминного концентрата, минеральные соли, отличающийся тем, что, с целью повыщения выхода целевого продукта за счет предотвращения его потерь, вызванных фаголизисом, осуществляют смещанное культивирование продуцентов L-лизина видов Corynebacterium glutamicum и Brevibacterium species.

со

СП

со

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению незаменимой аминокислоты L -лизнна.

Известен способ получения L-лизина путем культивирования штамма-продуцента Brevi- bacterium species в азробных условиях в водной питательной среде, содержашей мелассу как источник углерода (11 .

Однако данный способ не предусматривает мер предотвращения потерь конечного Продукт в процессе ферментации в случае фаголизисных операций.

Наиболее близким к предлагаемому по технической суИцюсти и достигаемому зффекту является способ получения L-лизина путем глубинного культивирования Corynebacterium glutamicum на питательной среде, содержашей мелассу, минеральные соли, гидролизат белково-витаминного концентрата 2.

Недостатком зтого способа является отсутствие мер предотвращения потерь конечного I продукта в процессе ферментации в случае .фаголизисных операций, что снижает выход лизина.

Цель изобретения - повыщение выхода целевого продукта за счет предотвращения его потерь, вызванных фагрлизисом.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения L-лизкна путем глуClglutamicum Т-3 С. glutamicum 95 Brevibacterium sp. 22 L

Brevibacterium sp. E 531

Таким образом, исходя из строгой родовой с- ецифичности изученных бактериофагов мож- 50 но проводить смешанное культивирование продуцентов вида C.gtutamicum и Brevibacterium . дня обеспечечення выхода конечного продукта за счет одной из используемых культур в случае возможного фаголизиса 55 параллельной культуры.

Можно допустить возможность одновремен нбго фаголизиса обоих культур, однако веробинного культивирования его продуцентов на питательной среде, содержащей мелассу в . качестве источника углерода, гидролизат белков о-витаминного концентрата, минеральные соли, осуществляют смешанное культивнрование продуцентов L-лизина видов Corynebacterhjni glutamicum и Brevibacterium species.

Сущность способа заключается в следующем В ходе изучения спектров литической активности фагов Corynebacterium glutamicum (МС-1, МС-2, МС-3, МС-4) и Brevibacterf-i um species (НФ, ЕФ, ФВ, ВВ), выделенных при производстве лизина на Чаренцаванском, Ливанском, Щебекинском и Обольском заводах, установлена их строгая родовая специфичность. Так, фаги C.glutamicum лизируют только штаммы C.glutamicum, а.фаги Breyibacterium sp. анализируют только ц;таммы Brevibacterium sp. (см. табл. 1 и 2).

В лабораторных опытах с применением .мутагенных факторов (1-метил-3-нитро-1-нитрозогуанидин, УФ-лучи) не удается получить мутантные фаги,- активные одновременно к бактериям обоих видов - C.glutamicum и Brevibac- terium sp.

В табл. 1 приведен спектр литической ... активности бактериофагов Clglutamicum и Brevibacterium sp.

Таблица 1

ятность этого будет значительно ниже.

Еще меньшим б5,дет вероятность одновре менного фаголизиса находящихся в смеси обоих штаммов-продуцентов в случае смешанного культивирования.

В табл. 2 приведен сравнительный спектр литической активности бактериофагов C.glu- tamicum и В rev (bacterium sp., выделенных при производстве лизина. C.glutamicum Т 3Лизин ++ + + + + ++ + +++ ++ + +++ РВР-26- М-08Гистидин++ + + + -f ГА 8Орнитин 1344 Глутаминоваяf+,+ ++кислотаАТСС 13032 Дикий тип АТСС 13286 + + + + f+ + . + + АТСС 13237 f lavum

П р и м е ч а я и (t V

- - отсутствие лизиса.

Таблица 2

наличие лизиса;

В табл. 3 приведены результаты ферментации L-лизина с применением смешанных культур C.glutamicum и Brevibacterium sp. (, ,95) э условиях заражения фагами обоBrevibacterium sp.22

их видов мик|Н№ргнииумоп, выделенных на производстве 1-ли:1И11а. Заражение фагом осуществлялось в начале ферментации, множественность заражения 1,0.

Таблица 3

27,OtO,5

Как видно из этих результаюв, накопление лизина в культуральной жидкости смешанных культур при заражении фагами находится на уровне контрольных ферментации, в то . время как ферментации, осуществленные с помощью одной из этих культур, при заражении теми же фагами давали накопление лизина в культуральной жидкости не более 8,5 г/л . Таким образом, в предлагаемом способе получения L-лизина цель достигается за счет смещанного культивирования продуцентов лизина C.glutamicumi и Brevibacterium sp., ко торое позволяет завершить процесс ферментации L-лизина без потерь целевого продукта в случае фаголизиса всей популяции клеток одной из введенных в ассоциацию культур продуцента.

Способ осуществляют следующим образом.

Культуры продуцентов L-лизииа, например C.glutamicum Т-3 и Brevibacterium sp Е531, после раздельного выращивания в .. колбах вносятся в равных объемах (1:1) в посевные аппараты нз расчета 0,02% посевного материала к объему питательной среды в аппарате. Питательная среда для выращивания cMeiiiaiffloro посевного материала в посевных аппаратах имеет следующий состав,%:

Меласса4,5-5,0

Кукурузный экстракт4,0 .

Натрий хлористый0,4

Продолжение табл. 3

-КНФ)

Натр едкий техн. 42% (для доведения рН до 7,8-8.0)0,4-0,5

Пропинол Б-400.0,17

Посевной Материал, состоящий из смешанной культуры обоих видов продуцентов, выращивается до достижения оптической плотности не менее 0,3, после чего передается для засев в производственные ферментеры с мелассной ферментационной питательной средой. Посевной материал вносится в количестве 1-3%.

Ферментационная питательная среда имеет соедующий состав,%:

Меласса20,0-22,0

Гидролизат БВК8,0-9,0

Аммоний хлористый0,6-1,0

Аммоний фосфорнокислый двухзамещенный0,04-0,045

Ферментацию проводят при 28-32 С, рН среды 6,8-7,3, аэрации и перевешивании в течение 60-65 ч. После окончания культивирования нз культуральной жидкости выделяют L-лизин известными методами или получают: кормовой концентрат L-лизина.

Пример 1. Культуры C.glutamicum Т-3 и Brevibacterium sp. Е531 (или 221) выращивают на косяках мясопептонного агара в течение 20-24 ч при 28-32 С. Культуры смьшают стерильньпл физиологическим раствором и полученные суспензии смешивают в равных объемах. Посевной материал вносят из расчета 5% от объема среды и выращивают в колбах Эрленмейера 250 мл с 10 мл среды на качалке при 28-32°С в течение 72 ч для биосинтеза лизина. При этом для имитации условий возможного фаголизиса культуры продуцента вида C.glutamicum биосинтез лизина проводят на фоне фага MC-I, лизирующего микроорганизмов, с концентрацией 8,5-lo бое/мл, рН 6,8-7,2. Состав ферментационной среды,%: Меласса20,0-22,0 Гидролизат БВК8,0-9,0 Аммоний хлористый0,6- 1,0 Аммоний фосфорнокислый двухзамещенный0,04-0,045 В конце ферментации содержание L-лизина в культуральной жидкости составляет 30,013 35,0 г/л. Биосинтез осуществлен ассоциативной культурой Brevibacterium sp. Е 531(221). Пример 2. Процесс осуществляется согласно примеру 1. В качестве фагового фона используют фаг ЕФ (или НФ), лизируюЩие культуры вида Brevibacterium sp. с концентрацией 5,3 10 бое/мл. Выход лиз1ша в конце ферментами 30,0-35,0 г/л. Биосинтез лизина осуществлен ассоциативной культурой С. glutamicum Т-3. Таким образом, предлагаемый способ позволяет по сравнению с известным повысить выход лизина до 30,0-35,0 г/л в то время как в случае фаголизиса выход составляет не более 8,5 г/л..