Способ получения антибиотика полимиксина Советский патент 1957 года по МПК C12P21/00 

Изобретением является способ получения антибиотика полимиксина из культуральной жидкости В. Роlymyxa.

Применение предлагаемого способа позволяет получать препарат высокой эффективности при лечении долго незаживающих ран, вызванных синегнойной палочкой.

Отличительная особенность способа заключается в том, что культуральную жидкость обрабатывают щавелевой кислотой, бактериальные к«1етки и выпавшие соли отфильтровывают, а прозрачный фильтрат подщелачивают едким натром, после чего антибиотик адсорбируют из раствора на катиопите КБ-4-П2 и элюируют 0,35 и раствором соляной кислоты в метаноле, из которого неорганические примеси удаляют адсорбцией на катионите СБС-1, а содержащий антибиотик раствор или нейтрализуют на анионите ЭДЭ-10, упаривают и сушат для выделения твердой солянокислой соли полимиксина, или нейтрализуют триэтиламином, добавляют к полученному раствору сульфат триэтила.мика з метано.ю, выпавший сульфат полпмлкслпа отфильтровывают, промьнзают метанолом и сущат в вакууме.

Пример 1. 90 л культуральной жидкости с активностью 2100 ед/мл определяют чашечным л1етодом с тест-организмом Escherichia СоИ, обрабатывают npii перемешивании насыщенным раствором щавелевой кислоты (2,6 ./) до достижения полноты осаждения кальция и рН раствора 3,0.

Выпавщий осадок оксалата кальция со взвесью бактериальных клеток отделяют фильтрованием, а прозрачный раствор нейтрализуют 10%-ным раствором едкого натра (1,75 л) до рП 6,5-7,0.

Прозрачный нативный раствор (96 л с активностью 1750 ед/ли) пропускают через колонку с диаметром 2,5 с.и и высотою 40 см. наполненную 7 г катионита КБ4-П2 в натриевой фор.ме, со скоростью л час1г. Иоиит с адсорбированным на нем полимиксином (92,3-10 ед) промывают 2 л дистиллированной воды до Достижения прозрачной

промывной воды, а затем /и мл метанола, после чего проводят вытеснение антибиотпка 0,35 к раствором соляной кислоты в метаноле со скоростью 10 лл/час/г ионита.

Полученные 300 мл раствора солянокислого полимиксина в метаноле нейтрализуют анионитом ЭДЭ-10 в ОН-форме и получают 340 мл раствора активностью 16,3-10 ед/мг.

Всего получают 55,4 10 ед, что составляет 60% по отношению к полимиксину, сорбированному на ионите. С учетом элюатов более низкой концентрации выход достигает 65%.

300 мл указанного выше раствора солянокислого полимиксина в метаноле профильтровывают через колонку с диаметром 3 см и высотою 60 см, наполненную 270 г катионита СБС-1 в Н-форме со скоростью 2 мл/час/г катионита. Затем кислый раствор нейтрализуют с помощью анионита ЭДЭ-10 до рН раствора 6,5.

Получают 373 мл раствора с активностью 118-102 ед/мл и 50 мл с активностью 27-10 ед/мл. Прямой выход антибиотика на стадиях обработки ионитами СБС-1 и ЭДЭ-10 90%. Общий выход на этих стадиях 94,8%.

Сухой препарат полимиксина из метанольного раствора солянокислого полимиксина выделяют так.

1. 170 мл раствора антибиотика после очистки ионитами СБС-1 и ЭДЭ-10 с активностью 118-10 ед/мл упаривают в вакууме при 35-40° до V4 первоначального объема; выпавщий при упаривании неактивный осадок отделяют фильтрованием, после чего прозрачный концентрат упаривают в вакууме досуха.

Получают 2,34 г солянокислого полимиксина с активностью 7100 ед/мг. Всего 16,6-106 ед. Выход на стадии упаривания и получения су.кого препарата 83%. Выход солянокислого полимиксина от антибиотика, сорбированного катионитом из культуральной жидкости, около 45%.

2. К 200 л{л раствора антибиотика с активностью 118- 10 ед/мл добавляют 2 н раствор триэтиламинсульфата в метаноле (13,5 мл) до полноты осаждения сульфата гголимиксина.

Выпавшую сернокислую соль антибиотика отделяют фильтрованием, промывают метанолом до отсутствия в промывном метаноле следов хлоргидрата и сульфата триэтиламина и высушивают в вакууме при комнатной температуре. Получают 1,56 г препарата с активностью 10-103 ед/мг. Всего 15,6- 10 ед.

Препарат растворяют в 30 мл дистиллированной воды, отделяют фильтрованием небольщой неактивный осадок и из прозрачного раствора добавлением 100 мл метанола осаждают сульфат полимиксина. Последний отделяют фильтрованием и высушивают в вакзуме при температуре не выше 45°.

Получают сульфата полимиксина 1,52 г с активпостью 10-10 ед/мг. Всего 15,2- 10 ед. Выход на стадии выделения сульфата полимиксина 64,4%. Общий выход иолимиксина от антибиотика, сорбированного катионитом из кзльтуральной жидкости, 36,0%.

Прим,ер 2. 75 л культуральной жидкости с активностью 2300 ед/мл определяют чащечным методом с тест-организмом Escherichia Coli, обрабатывают при перемешивании насыщенным раствором щавелевой кислоты (2,5 л) до достижения полноты осаждения кальция и рП раствора 3,0. Выпавщий осадок аксалата кальция со взвесью бактериальных клеток отделяют фильтрованием, а прозрачный нативный раствор нейтрализуют 10%-ным раствором едкого натра (1,75 л) до рН 6,5-7,0.

75 л прозрачного нативного раствора с активностью 1900 ед/мл пропускают через колонку с диаметром 2,5 см и высотою 40 см, наполненную 5 г катионита КБ4-П2 в натриевой форме со скоростью 1 . В фильтрате - 65-10 ед; сорбировано ионитом 77-10 ед.

Ионит с адсорбированным на нем полимиксином промывают 1,8 л дистиллированной воды до достижения прозрачной промывной воды и затем 50 г метанола, после чего проводят вытеснение антибиотика 0,35 н раствором соляной кислоты в метаноле со скоростью 50 мл/час/г ионита.

Полученные 320 мл раствора солянокислого полимиксина в метаноле нейтрализуют анионитом ЭДЭ-10, после чего получают 350 мл раствора с активностью 15,2-10 ед/мл и общим содержанием антибиотика 53,2-106 ед, что составляет 67,2% по отношению к полимиксину, сорбированному на ионите.

С учетом элюатов более низкой концентрации выход достигает 71%. Емкость катионита по отношению к полимиксину 15,4-10 ед/г.

320 мл (общая активность 48,6-10 ед) указанного выше раствора солянокислого полимиксина в метаноле профильтровывают через колонку высотою 60 см и диаметром 3 см, наполненную 260 г катионита СБС-1 в Н-форме со скоростью 2 мл/час/г катионита.

Получают 365 мл раствора; активность 12,7-10 ед/мл; общая активность 46,3-10 ед. Прямой выход на стадии обработки СБС-1 95%. Обший выход с учетом слабых промывок 98,0%.

Выделение сухого препарата полимиксина из метанольного раствора солянокислого полимиксина производится следующим образом.

1. 200 мл кислого раствора антибиотика (общая активность 25,4-10® ед), очищенного с подгощью ионита СБС-1, нейтрализуют до рН 6,6 фильтрацией через анионит ЭДЭ-10. Объем раствора 225 мл. Активность 11-Ю ед1мл. Общая активность 24,7 - 10 ед.

220 мл нейтрализованного раствора солянокислого полимиксина концентрируют до /4 первоначального объема в вакууме при температуре 35-40°.

Выпавший при упаривании осадок отделяют фильтрованием, после чего концентрат высущивают в вакууме досуха.

Получают 3,06 г солянокислого полимиксина. Активность препарата 6800 ед1яг. Всего 20,8-10 ед. Выход на стадии получения сухого препарата 86%. Выход солянокислого полимиксина от антибиотика, сорбированного катионитом изкультуральной жидкости, 51,0%.

2. 150 мл кислого раствора антибиотика, полученного после очистки катионитом СБС-1 с активностью 12,7-10 ед1мл нейтрализуют 8 мл триэтиламина до рН 6,5. К нейтрализованному раствору добавляют 12,5 мл 2 н раствора триэтиламинсульфата в метаноле до полноты осаждения сульфата полимиксина.

Выпавшую сернокислую соль антибиотика отделяют фильтрованием, промывают метанолом до отсутствия в промывном метаноле следов хлоргидрата и сульфата триэтиламина и высушивают в вакууме при комнатной температуре.

Получают 1,35 г препарата с активностью 9- 10 ед1мг. Всего 12.1-106 ед.

Препарат растворяют в 25 мл дистиллированной воды, отделяют фильтрованием небольшой неактивный осадок и из прозрачного раствора добавлением 100 мл метанола выделяют сульфат полимиксина. Последний отделяют фильтровани: ем, высушивают в вакууме при температуре не выше 45°.

Получают сульфата 1.3 г активностью 9-10 ед.мг. Всего 11,(3. Выход на стадии выделения сульфата полимиксина 61.4%. Общий выход сульфата полимиксина от антибиотика, сорбированного катионитом из культуральной жидкости, 38%.

Предмет изобретения

Способ получения антибиотика полимиксина из культуральной нсидкости В. Polymyxa. отличающийся тем, что, с целью получения препарата высокой эффективности, культуральную жидкость обрабатыв ают щавелевой кислотой, бактериальные клетки и выпавшие соли отфильтровывают, а прозрачный фильтрат подщелачивают ед№ 111195 КИМ натром, после чего антибиотик адсорбируют из раствора на катионите КБ-4-П2 и элюируют 0,35 н раствором соляной кислоты в метаноле, из которого неорганические примеси удаляют адсорбцией на катиониге СБС-1, а содержащий антибиотик раствор или нейтрализуют на апионите ЭДЭ-10, упаривают и сушат для выделения твердои солянокислой соли полимикси. нейтрализуют триэтилами ° добавляют к полученному раствору сульфат триэтиламина. в метаноле, выпавший сульфат полимиксина отфильтровывают, промывают метанолом и сзшат в ваку)ме.