Способ получения антибиотика сисомицина Советский патент 1977 года по МПК C12P17/06 A61K31/351 A61P31/04 C12P17/06 C12R1/29 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТШСА СИСОМЩИНА Штамм хорошо расгегпри 28-37° С. При температуре 50° С никакого роста не наблюдается. На среде из глюкозы и аспаргинового агара рост оказьшается плохим. Растущая колония штвмма гидролизует желатину, молоко, крахмал и восстанавливает нитрат натрия. П р и м е р 1. В колбу со 100 мл питательной среды, содержащей, г/л: 8 мясного экстракта, 5 триптона, 5 дрожжевого экстракта, 1 декстрозы, 24 крахмала и 2 карбоната кальция, вносят лиофильно высушенную культуру штамма или кратки, полученные из скоиюнной культуры, и выращивают 5 суток при 35° С на вращатъщемся вибраторе. 25 мл культуральной жидаости, полученной на этой стадии, вносятв колбу с 500 мл питательной среды того же состава и выращивают 3 суток при 28° С на вращающемся вибраторе. В, сосуд емкостью 14л вносят 500 мл культуральной жидкости, полученной на второй стадии, и 9,5 л питательной среды, содержащей 50 г/л декстрина, 5 г/л декстрозы, 35 г/л соевой муки, 7 г/л карбоната кальция, 10 моль/л хлористого кобальта и 10 мл пеногаситёля. Значение рН среды устанавливают на уровне 8 и осуществляют культивирование в течение 66-90 час при перемешивании (250 об/мин) и аэрации (4,5 л/мин при 22,5 атм). Полученную культуральную жидкость подкисляют 6 н. сер1юй кислотсж до рН 2 и оставляют для дальнейшей обработки. 170л подкисленной культуральной жидкости фильтруют, промьшая мицелий водой, и добавляют щавелевую кислоту, осаждают кальциевые соединения, выпавший осадок отфильтровывают, а фильтрат нейтрализуют аммиачной водой и п{Х)пускают через колонку с 1500-2000 г катионита (амберлит PC-50) в аммонийной форме. Смолу промывают водой и элюируют 2н-раствором аммиака, собирая фракции по 400 мл. Активные фракдаи объединяют, упаривают в вакууме досуха и получают 28 г сырого антибиотика с активностью 500 мкг/мгДля очистки 28 г сырого антибиотика растворяют 100мл дистиллированной воды и пропускают через колонку с анионитом. Элюцию производят дистиллированной водой, собирая фраюши по 100 мл. Активные фракции пиофильно высушивают и получают 5,7 г антибиотика с активностью 900 1кг/кг. Для получения сернокислой соли 3,9 г основания антибиотика, полученного как это описано вьиие, растворяют в 60 мл воды и доводят значение рН до 4,5 добавлением 6 н. серной кислоты. Раствор обрабатывают активированным углем, фильтруют и осаждают препарат добавлением 1 л метанола. После фильтрования . и высушивачия получают 4,8 г сернокислой соли антибиотика с активностью 640мкг/кг. П р и м е р 2. 200 г порошка целлюлозы типа Уотман Nrl смсишпатт с 20 мл растворителя хлорх-)форм /метанол/ 17/;.--,;ая гидроокись аммония (2:1:1) и полпки в колонки .аиамстром 6,36 мм и высотой 508 мм. Растворитель пропускают чере колонку до появления желтой полосы примесей. 2 i сульфата антибиотика растворяют приблизительно в 3 мл растворителя, смешивают с некоторым коли«юством порошка целлюлозы, высушивают под вакуумом и подают в верх колонки. Пропуская через колонку со скоростью I мл в 1 мин, собирают фракщги по 5 мл через каждые 15 мин. Фракции - 180 соединяет, вьшаривают, вн(вь растворяют в воде и пропускают через IRA 4 01S анионообмен 1ую смолу в гидроксильном виде. Серной кислотой значение рН злюата устанавливают на 4,5, раствор обрабатывают углем, фильтруют и концентрируют, в концентрат добавляют избыток метанола, образовавшийся белый осадок отделяют фильтрованием. Осадок растворяют в воде, раствор пропускают через колонку из смолы типа 1RA 40IS в гидроксильной форме. Вытекающий поток собирают, концентрируют, подвергают лиофильной сушке и получают приблизительно 300 мг антибиотика в виде основания с активностью 1000 мкг/мг. П р и м е р 3. 104,7 г антибиотика в виде основания растворяют в 4 мл воды, хлористоводородной кислотой значение рН раствора устанавливают на 4,5. Раствор выпаривают, остаток растворяют в метаноле. К раствору добавляют избыточное количество ацетона, вьшавший осадок отфильтровывают и получают 130мг гидрохлорида антибкотика активностью 753 мкг/мг. Пример 4.Приготовление кристаллического моногидрата антибиотика. Готовят хроматографическую колонку из геля двуокиси кремния, используя в качестве растворителя смесь изопропанол /СНС1з/ гидроокись аммония (1:2:1). 1 г антибиотика в виде основания растворяют в 5,0 мл растворителя, адсорбируют фракции по 5,0 мл и определяют расположение фракций тонкослойной хроматографией на плитах из геля двуокиси кремния. Подходяигеге фракции (44-78) соединяют и вьшаривают под вакуумом, при этом получают светло-желтую :1кидкость, которую путем азеотропной дистшгляшда с этанолом кристаллизуют в светло-желтые розетты. По; ученный продукт представляет собой моногидрат антибиотика. Т.пл. около 180--185°С; выход 650 мг. П р и м е р 5. Пол) продукта конденсации антибиотика с бензальдегидом. 5,0 г антибиотика в 60 мл абсолютного этанола брабатывают 5,9 г бензальдегида, ре1щркулируют в ечение 1 час. Раствор охлаждают и фильтруют, получают ,01 бе.:ого кристаллического вещества, т.пл. 123-126° С, tt|. +43,2, концентрация 0,3л в СНС1з. Элементарньт анализ показывает пять бензальдегидных остатков. Аналогично заметая бензальдегидный реагент эквивалентным количеством одного из следующих альдегидов: ацетальдегид, фурфурол, диклопенталацетальлсгид, кроюиальдегид, салицилальдегид, валииил, верлтральясгид. псридоксал. получают соогветCTisviounie про.чукты конденсации с альдегидчми. 5 Формула изобретения Способ получения антибиотика сисомнияна, о т личающийся тем, что штамм культуры NRRL cj 3292 Mieromonospora ingoensis или мутант, соответствующий ему в отношении основных микромерфологических и физиологических свойств и способности продуцировать целевой продукт, выраидивают в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при 20-40°С и рН 6,8-8,0 и выделяют целевой продукт в свободном виде или в виде продукта конденсации с альдегидом, или в виде гидратов иэвестными приемами.