Способ разделения лимфоцитов периферической крови Советский патент 1982 года по МПК A61K35/14 

1

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и касается разделения лимфоцитов периферической крови, используемых для имуннизации с целью получения диагностических специфических анти-Т и анти-В сывороток, а также для изучения роли тканевых антигенов локуса HLA - DR в иммунном ответе.

Известен способ разделения лимфоцитов периферической крови путем проведения реакции розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами с последующим центрифугированием полученных розеток в градиенте плотности фиколл-верографин.

Недостатком известного способа является то, что используют дорогостоящий, дефицитный фермент, а также длительность постановки реакции по этой методике.

Целью изобретения является упрощение способа.

Цель достигается тем, что предлагаемый способ разделения лимфоцитов периферической крови осуществляют путем проведения реакции розеткообра- зования лимфоцитов с эритроцитами с последующим центрифугированием полученных розеток в градиенте плотности фиколл-верографин, перед проведением реакции розеткообразования один из компонентов реакции облучают трафиолетовыми лучами при длине волны 250-260 нм в дозе 1, 3-1 ,8-10 эрг/см в течение 1-1,5 мин.

При этом облучению подвергают лимфоциты и эритроциты.

Способ осуществляют следующим образом.

Кровь берут методом пункции локтевой вены донора. Дефибринирование ее производят немедленно после взятия, перемешивания деревянной палочкой или встряхивания со стеклянными бусами в течение 10 мин. Для приготовления градиента плотности 9)б7 граммов фи3копла растворяют в 12.,5 мл дистилли рованной воды и смешивают с. 20 мл 7б%-ного верографина. Удельный вес полученной смеси равен 1,077 Ь079 г/мл. Дефибринированную кровь смешивают с равным объемом раствора Хенкса, тщательно перемешивают встря хиванием и осторожно по стенке пробирки наслаивают на градиент плотнос ти фиколл-верографин в соотношении .2:1. Центрифугируют в рефрижераторной центрифуге при 600 g и -f С в течение 30 мин. Клетки, скопившиеся на границе раздела двух фаз и визуально определяемые в виде опалесциру щего кольца, осторожно отсасывают с помощью пастеровской пипетки или шприца с длинной иглой. Клеточная взвесь представляет собой преимущест венно мононуклеары, содержание лимфоцитов в ней при микроскопическом контроле должно быть не менее 95 Полученную суспензию лимфоцитов отмывают дважды, добавляя смесь инактивированной сыворотки группы АВ (IV) и раствора Хенкса (1:10) и центрифугируя при 600g в течение 5 мин. Суспендируют лимфоциты в смеси равных объемов инактивированной сыворотки крови группы АВ (IV) и раствора Хенкса (без фенолового красного) в концентрации ,5-Ю кл/ Для получения лимфоцитов суспензию лимфоидных клеток в указанной концентрации наливают в бюксы кварце вого стекла так, чтобы толщина слоя жидкости была в пределах 8-12 мм. В бюкс опускают тонкий металлический стержень, длина которого соответству ет диаметру бюкса и помещают его на магнитную мешалку. Скорость вращения стержня должна быть около 30-tO об/м Облучение проводят с помощью бактери цидной лампы ДБ-ЗОп, основная часть излучения которой имеет длину волны 25t/. Доза облучения 1 ,3-1 ,8-10 эрг/мМ Облучение проводят в течение 1-1,5 м Расстояние между трубкой и облучаемо поверхностью 15-20 см, Эритроциты барана получают методо пункции яремной вены животного, дефибринируют перемешиванием деревянными палочками и течение 10 мин и сохраняют а растворе Элсвера (глюко за 2,5 гр, лимоннокислый натрий 0,8 г и поваренная соль 0,2 г на 100 мл дистиллированной воды). Предельный срок хранения эритроцитов 3 недели. Перед постановкой реакции розеткообразования эритроциты барана трижды отмывают раствором Хенкса и суспендируют в концентрации 4,5 510кл/мл в смеси равных объемов инактивированной и дважды сорбированной эритроцитами барана сыворотки крови группы, АВ (IV) и раствора Хенкса. Взвесь облученных лимфоцитов в концентрации , смешивают с равным объемом.взвеси бараньих эритроцитов (концентрации 4,5-510) , тщательно перемешивают и инкубируют в течение 30 мин при 37 С. Затем центрифугируют при 400g в течение 10 мин и помещают на 1 ч в холодильник (+,С). Указанную смесь наслаивают на градиент плотности фиколл-верографин (состав смотри выше) в соотношении 2:1 и центрифугируют при 600g в течение 30 мин. На границе двух фаз появляется опалесцирующее кольцо, представляющее собой взвесь В-лимфоцитов, которые собирают пастеровской пипеткой или шприцем с длинной иглой, дважды отмывают смесью раствора Хенкса и инактивированной сыворотки крови группы АВ (IV) в соотношении 10:Т и суспендируют в этой же смеси в концентрации, необходимой для дальнейшей -работы. Осадок представляет собой Т-лимфоциты, нагруженные бараньими эритроцитами. Для того чтобы лизировать бараньи эритроциты, осадок заливают 10 мл смеси, содержащей Маг2ЭДТА - 0,021 (1 часть)и 0,83 (9 частей) , приготовленных extempore, выдерживают 10 мин при и центрифугируют при 600g в течение 10 мин. Полученную взвесь Т-лимфоцитов дважды отмывают раствором Хенкса и доводят до нужной концентрации. Пример 1, Из периферической крови донора тест-клеток выделяют лимфоциты. Для этого к 16 мл дефибринированной крови добавляют 16 мл раствора Хенкса, тщательно перемешивают и наслаивают на фиколл-верографин в отношении 2:1. Отцентрифугируют при t°C 30 мин при об/мин на рефрижераторной центрифуге К-70.Слой клеток, скопившийся на границе раздела 2-х фаз, осторожно собирают пастеровской пипеткой и дважды отмывают инактивированной сывороткой АВ (IV группы), разведенной раствором Хенкса в 10 раз. Клетки суспендируют в концентрации 5-10 кл/мл в смеси рав5Вных объемов инактивированной сыворотки группы АВ (IV) и раствора Хенкса. Взвесь лимфоцитов а 50%-ной сыворотке крови группы АВ (IV) помещают в стеклянные бюксы, толщина слоя взвеси 10 мм (около 1 мл) и облучают ультрафиолетом с длиной волны 2S им в дозе 1,3-10 эрг/мм в течение 1 мин Расстояние между трубкой и.облучаемой поверхностью 15 см. Облучение про водят при постоянном перемешивании суспензии с помощью магнитной мешалки. Из эритроцитов барана, трижды отмытых раствором Хенкса, готовят взвесь с концентрацией 5-10 кл/мл в инактивированной и дважды сорбирован ной эритроцитами барана сыворотке кр ви АВ (IV), разведенной равным объемом раствора Хенкса. 5 мл суспензии облученных лимфоцитов смешивают с равным объемом взвеси бараньих эритроцитов в указанных концентрациях, тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при , затем центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин и выдерживают в холодильнике при +А С в течение 1 ч. Указанную смесь наслаивают на фиколл-верографин в отношении 2:1, центрифугируют при об/мин в течение 30 мин. Образовавшийся на границе двух фаз слой клеток, содержащий В-лимфоциты, осторожно собирают пастеровской пипеткой и дважды отмывают смесью раствора Хенкса и 10%-ной инактивированной сыворотки крови группы АВ (IV) в соотношении 10:1. Осадок, представляющий собой Т-лимфоциты, нагруженные эритроцитами барана,обра батывают смесь 0,02% (1 часть) и 0,83% (9 частей), приготовленных extempore для лизис бараньих эритроцитов в течение 10 ми Затем полученную взвесь Т-лимфоцитов дважды отмывают раствором Хенкса. Результаты тестов, поставленных по ходу опыта следующие. Розеткообразование определяют по числу активных Т-розеток. Необлученных лимфоцитов с эритроцитами барана 46,2ig. Облученных лимфоцитов с эритроцитами барана 77,3%. Жизнеспособность лимфоцитов в полученных субпопуляциях (по трипаново В-лимфо му синему). Т-лимфоциты циты 97. Чистота полученных субпопуляций (методом подсчета розеток с Т-лимфоцитами (Т-РОК), Т-лимфоциты В-лимфоциты 97%. Пример 2. Из периферической крови донора тест-клеток выделяют лимфоциты. Для этого к 16 мл дефибринированной крови прибавляют 16 мл раствора Хенкса, тщательно перемешивают и наслаивают на фиколл-верографин в отношении 2:1. Центрифугируют при Й50 об/мин, в течение 30 мин на рефрижераторной центрифуге К:-70. Снимают образовавшееся на разделе двух фаз кольцо лимфоцитов шприцем с длинной иглой и дважды отмывают их инактивированной сывороткой крови группы АВ (IV), разведенной раствором Хенкса в 10 раз. Концентрацию клеток доводят до 5 -10 в 1 мл с помощью инактивированной сыворотки крови группы АВ (IV), наполовину разведенной раствором Хенкса. Взвесь лимфоцитов в сыворотке крови группы АВ (IV) помещают в стеклянные бюксы, толщина слоя 12 мм и облучают ультрафиолетом,,с длиной ВОЛНЫ дозе 1,8- 10 эрг/мм в течение 1,5 мин. Расстояние между трубкой и облучаемой поверхностью 20 см. Облучение проводят при постоянном перемешивании суспензии с помощью магнитной мешалки. Из трижды отмытых эритроцитов барана готовят взвесь с концентрацией 4,5-10 кл/мл в инактивированной и дважды сорбированной эритроцитами барана сыворотке крови группы АВ (IV), пополам разведенной раствором Хенкса. Смешивают равные объемы облученных лимфоцитов и бараньих эритроцитов в указанных концентрациях, тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при 37°С, гатем центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин и выдерживают в холодильнике при +k°C в течение 1 ч. Указанную смесь наслаивают на фиколлверографин в соотношении 2:1, центри фугируют при Й50 об/мин в течение 30 мин. Образовавшееся на границе двух фаз кольцо, содержащее В-лимфоциты, осторожно снимают. Взвесь клеток дважды отмывают раствором Хенкса с добавлением в него инактивированной сыворотки крови группы АВ (IV) и доводят до нужной концентрации. 7 Осадок, представляющий собой Т-лимфоциты, нагруженные эритроцитам барана, обрабатывают смесью Na(j ЭДТА 0,02 (1 часть) и NH4C1 0,83% (9 ча стей), приготовленных extempore для лизиса бараньих эритроцитов, в течение 10 мин. Затем полученную смесь Т-лимфоцитов дважды отмывают раствором Хенкса и доводят до нужной концентрации. Результаты тестов, полученных по ходу опыта следующие. Розеткообразование определяют по числу активных Т-розеток. , ,.. Необлученных лимфоцитов с зритроцитами барана . , Облученных лимфоцитов с эритроцит теми барана 58,%. Жизнеспособность лимфоцитов в полученных субпопуляциях (по тр ипановому синему) Т-лимфоциты 98%, В-лимфоциты 96t. Чистота полученных субпопуляций (методом подсчета Т-РОК) Т-лимфоциты 97%i В-лимфоциты 97%. Предложенный способ позволяет ра делить лимфоциты периферической кро ви и получить субпопуляции клеток g высокой степени чистоты, способ не .требует дефицитного импортного фермента, при этом обработка известным способом занимает 1,5 ч, а облучение предложенным способом 2 мин. Формула изобретения 1.Способ разделения лимфоцитов периферической крови путем проведения реакции розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами с последующим центрифугированием полученных розеток в градиенте плотности фиколл-верографин, отличаюЩИйся тем, что, с целью упрощения способа, перед проведением реакции розеткообразования один из компонентов реакции облучают ультрафиолетовыми лучами при длине волны 250-260 нм в дозе 1,31,8-10 эрг/см а течение 1-1,5 мин. 2.Способ по п.1, отличающий с я тем, что облучению подвергают лимфоциты. 3.Способ по пп.1-2, отличающийся тем, что облучению подвергают эритроциты.