Способ получения препарата для оценки хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили Советский патент 1991 года по МПК C12N1/14 A01N63/04 

смешивают с двуокисью кремния и каолином в соотношении 1;3-1 4, причем двуокись кремния и каолин берут в соотношении 2:1. Полученный препарат обработки семян хлопчатника перед высевом с целью оценки хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили (Ч КГ).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1.200 г (20%) мелко нарезанного картофеля и 150 г (15%) капусты заливают 1 л воды, доводят до кипения, кипятят 20 мин, фильтруют. В отвар вносят при перемешивании 0,5 г (0,05%) магния сернокислого, по 1 г (0,1%) фосфорнокислого однозамещенного калия и щавелевокислого калия, 20 г (2%) глицерина, 0,7 г (0,07%) дрожжевого экстракта и доводят объем до 1 л, В качалочные колбы емкостью 750 мл разливают по 100 мл приготовленной среды и стерилизуют при 1 эти 30 мин.

Стерильную рабочую среду инокулиру- ют 48-часовой посевной культурой гриба, выращенной глубинно на качалке (200 об/мин), при 2б°С. Норма засева 10%. Посевная среда состоит из картофельного от- вара (200 г картофеля на 1 л воды), в который вносят20 г(2%) глюкозы, 100г(10%)амино- пептида, 1 г (0,1 %) дрожжевого экстракта.

Инфекционный материал выращивают на качалке (200 об/мин) при 26°С в течение 3 сут. Биомассу отделяют центрифугированием, смешивают ее с наполнителем в отношении 1:3-1:4 по сухому веществу и сушат в хорошо вентилируемом помещении при 37°С в течение 24 ч. В качестве наполнителя используют двуокись кремния и каолин в отношении 2:1. Увеличение количества каолина уменьшает влагоемкость и разрыхляющие свойства наполнителя. Полученный инокулюм применяют для создания ИЙФ при оценке хлопчатника на устойчивость путем предпосевной обработки семян хлопчатника. Для этого увлажненные семена тщательно обваливают сухим препаратом из расчета 160 г препарата на 1 кг семян подсушивают их на воздухе и высевают. П р и м е р 2. Влияние компонентного состава среды на целевой продукт.

Необходимость включения в среду каждого компонента обоснована данными табл.1. Предлагаемое сочетание компонентов питательной среды в указанных количествах увеличивает выход и патогенность инфекционного начала (варианты 9.10,11) по сравнению с известными средами. Кроме этого повышается качество биомассы, а именно, пигментация мицелия и оболочек конидий, формирование конидий, типичных

для вида по форме и размеру (до 70 % вместо 20%).

Уменьшение содержания в питательной среде картофеля, капусты, глицерина, дрожжевого экстракта, солей калия и магния ниже 200; 100; 10. 0,5; 0,5; 0,3 г/л соответственно приводило к снижению выхода биомассы и эндоконидий, а повышение содержания перечисленных компонентов

0 выше 200; 200; 30; 1;2; 0,7 г/л вело к увеличению общей биомассы, но одновременно уменьшало количество эндоконидий в ней до 17-30%, повышало морфологическую неоднородность эндоконидий и снижало

5 синтез меланина.

Внесение щавелевокислого калия и отвара капусты способствует повышению выхода биомассы, а также стабилизации морфологического типа патогена, интенсив0 ной пигментации мицелия и оболочек эндоконидий, что обеспечивает сохранение жизнеспособности и вирулентности материала в природных условиях. Последующее отделение биомассы и смешивание ее с вла5 гоемким разрыхляющим наполнителем позволяют получить препарат для создания ИИФ с содержанием 900-1250 млн. инфек- ционнь х единиц в 1 г препарата. В качестве наполнителя и прилипателя используют

0 двуокись кремния и каолин в соотношении 2:1, что обеспечивает получение препарата в виде тонкого порошка, хорошо удерживающегося на семенах хлопчатника, и дает возможность применять его для опудрива5 ния семян, сократив тем самым норму расхода биомассы гриба в 5-6 раз.

Каждый из этих компонентов несет определенную функциональную нагрузку: каолин повышает удерживаемость готового

0 препарата на семенах хлопчатника, но плохо поглощает влагу, превращая отфильтрованную биомассу (пасту) в глину. Чтобы этого избежать, нужно увеличивать его количество, что ведет к снижению инфекцион5 ной нагрузки на семя Двуокись кремния хорошо адсорбирует влагу, но может повредить клетки из-за быстрого их обезвоживания слабее, чем каолин, удерживается на семенах хлопчатника, что также снижает ин0 фекционную нагрузку.

Сочетание компонентов накопителя двуокись кремния -- каолин в соотношении 2:1 придает целевому продукту качественно новые свойства: делит препарат более гомо5 генным, позволяет избежать упомянутых нежелательных последствий их раздельного применения, изменить способ применения препарата для создания ИИФ, удешевить продукт значительно снизив норму внесения препарата на гектар, повысив одновременно инфекционную нагрузку до 4 млн.инф. ед./семя, увеличить срок хранения препарата до одного гида.

П ри м е рЗ. Сравнительные результаты выращивания T.basicola на среде по пред- -ложенному способу и питательной среде, состоящей из морковного отвара.

Морковную среду готовят в соответствии с методикой А.П.Климовой: 200 г моркови заливают 1 л воды, варят 40 мин, фильтруют. Фильтрат разливают по 100 мл в качалочные колбы емкостью 750 мл и стерилизуют при 1 ати 30 мин. Дальнейшее выращивание ведут согласно примеру 1.

Результаты представлены в табл.2.

Как видно из таблицы, при глубинном способе выращивания T.basicola титр конидий в 10 раз выше, а биомасса в 3 раза больше, чем на известной морковной среде.

П р и м е р 4. Рост различных штаммов T.basicola на предложенной среде.

Получение препаратов осуществлялось так же, как в примере 1, патогенность оценивалась по проценту пораженных растений хлопчатника общепринятыми методами.

П р и м е р 5. Получение препарата в производственных условиях.

Производственное выращивание культуры T.basicola осуществляют в ферментерах емкостью 50-100 л, снабженных барботером и мешалкой (200 об/мин) на пи- тательной среде, содержащей, мас.%: дрожжевой экстракт 0,1, картофель 20,0, капуста 20,0, глицерин 3,0, щавелевокислый калий 0,2, фосфорнокислый однозамещен- ный калий 0,2, сернокислый магний 0,07, вода остальное. Коэффициент заполнения аппарата 0,6. Использован синтетический пеногаситель. Аэрация ступенчатая 0,3-1 объем воздуха (объем среды в 1 мин). Био- массу от культуральной жидкости отделяют сепарацией. В остальном технология получения и применения такая же, как описана в примере 1.

Инокулюм для засева производственной среды выращивают глубинно, на качалке (180-220 об/мин) в качал очных колбах емкостью 750 мл с объемом среды 100 мл или в 5-литровых бутылях с объемом среды 1 л. Количество внесенного посевного материала составляет 10% от объема производственной среды.

На данной среде гриб растет в виде пушистого, гомогенного, фактически неокрашенного мицелия. Выход биомассы со- ставляет 6-28 г/л по сравнению с 3-6 г/л на картофельно-глюкозном отваре или других известных вариантах среды.

Примерб. Сравнение препаратов, полученных предложенным и известным способами.

Для создания искусственного инфекционного фона применяют препарат, полученный при выращивании патогена глубинно на качалке в 5-литровых бутылях, содержащих 1 л пита.тельной среды следующего состава, мас.%: дрожжевой экстракт 0,05, картофель 15,0, капуста 10,0, глицерин 1,0, щавелевокислый калий 0,05, фосфорнокислый однозамещенный калий 0,05, сернокислый магний 0,03, вода остальное. Норма засева 10%. Биомассу от культуральной жидкости отделяли сепарацией. В остальном технология получения и применения препарата, как в примере 1.

Известный способ получения биопрепарата для создания ИИФ включает поверхностное чыращивание гриба на твердой среде, а именно: пшене, пропитанном картофельным отваром, содержащим дополнительно аминопептид и (или) дрожжевой экстракт, Глубинный метод культивирования гриба применяется только на стадии получения посевного материала для заражения пшена.

Результаты сравнения препаратов приведены в табл.5 и 6.

На полученном ИИФ проведена оценка 19 сортов хлопчатника. При этом были получены четкие различия между сортами по степени восприимчивости к осенней форме проявления заболевания, что было невозможно на инфекционном фоне, созданном по известному способу,

Таким образом, предложенный способ позволяет получить более гомогенный препарат для оценки хлопчатника на устойчивость к черной гнили с большей концентрацией инфекционного начала, чем известные ранее, применение которого позволяет обеспечить проявление осенней формы заболевания и снизить норму расхода препарата и затраты на его применение.

ф о рмула изобретения

Способ получения препарата для оценки хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили, включающий выращивание гриба Thielaviopsis baslcola на питательной среде, содержащей дрожжевой экстракт и воду, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и патогенности инфекционного начала, в среду дополнительно вносят картофель, капусту, глицерин, щавелевокислый калий, фосфорнокислый однозамещенный калий, сернокислый магний при следующем соотношении компонентов, мас.%: дрожжевой экстракт 0,05-0,1; картофель 15,0-20,0; капуста 10,0-20,0; глицерин 1,0-3,0; щавелевокислый калий 0,05-0,2:

фосфорнокислый однозамещенный калий 0,05-0,2; сернокислый магний 0,03-0,07; вода остальное, при этом процесс культивирования осуществляют глубинным -методом

при перемешивании, после культивирования биомассу гриба отделяют и вводят смесь двуокиси кремния и каолина в соотношении 2:1.

Изобретение относится к биоте хнике и защите растений от болезней, в частности к способам получения инфекционного материала грибов с целью создания искусственного инфекционного фона при селекции хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили. Цель изобретения - повышеИзобретение относится к биотехнологии и защите растений от болезней, в частности к способам получения инфекционного материала грибов с целью создания искусственного инфекционного фона (ИИФ) при селекции хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили Цель изобретения - повышение выхода и патогенности инфекционного канала. Способ осу и (ествля ют следующим образом. ние выхода и патогенности инфекционного начала. Способ заключается в следующем: готовят питательную среду следующего состава, мас.%: дрожжевой экстракт 0,05-0,1; картофель 15,0-20,0; капуста 10,0-20,0; глицерин 1,0-3,0; калий щавелевокислый 0,05- 0,2; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,05-0,2; магний сернокислый 0,03-0,07; вода остальное. Питательную среду засевают культурной гриба Tbacicola - возбудителя черной корневой гнили хлопчатника - и культивируют при 26°С в течение 4 сут. Биомассу отделяют и смешивают с двуокисью кремния и каолином в соотношении 1:3-1:4, причем двуокись кремния и каолин берут в соотношении 2:1. Полученным препаратом обрабатывают семена хлопчатника перед высевом с целью оценки хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили. Предлагаемый способ позволяет увеличить титр гриба с 48,7 до 190 млн/мл и обеспечить пораженность взрослых растений с 10,9 до 41,7%, а всходов с 47,4 до 60,8%. 6 табл. (А С Готовят питательную среду следующего состава, мас.%: дрожжевой экстракт 0,05- 0,1, картофель 15,0-20,0, капуста 10,0-20,0, глицерин 1,0-3,0, щавелевокислый калий 0,05-0,2, фосфорнокислый калий однозамещенный 0,05-0,2, сернокислый магний 0,03-0,07, вода остальное. Питательную среду засевают культурой гриба T.basicola, возбудителя черной корневой гнили хлопчатника и культивируют при 26°С в течение 4 сут. Биомассу отделяют и О 00 ю ю

0

0

5

,7

,4

,9

200 - 200 200 200 200 200 100 200 - -

1,0 ----- о,5 0,5

1,7 18,7

3,5 3,7 30,0 68,7

20 20

5,0 Ь,1 6,6 92,5 65,0 70,5

20

1,5 6,8

75,0

Таблица 1

200 150 2001200

0,5 0,5 Г 0,71,0

0,5 0,5 1,02,0

0,5 20

20

10

20

30

1,5 6,8

75,0 35,0 82,5 130,0 190,0 154,0

60,8

41,7

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Таблица 6