1-(2-Оксиэтоксиметил)-1,2,4-триазол-5-карбоксамид,обладающий активностью противвируса герпеса Советский патент 1986 года по МПК C07D249/14 A61K31/4196 A61P31/22 

Изобретение относится к области органической химии, медицинской хи мии и вирусологии, конкретно иэрбретение касается нового соединения I-С2-оксиэтоксиметил)-1,2,4-триазол 5-карбоксамида формулы I Г jLcr 0 -NH2 СН20СН2Ш20Н являющегося новым антивирусным веществом, избирательно подавляющим репродукцию вируса простого герпеса Изобретение может быть использов но в вирусологии для подавления репродукции вируса герпеса. Известен противовирусный препара рибавирин (виразол, 1 ,1 - ) -рибуфуранозил ,2,4-триазол-З-карбокса мид), который является структурным аналогом гуанозина, Рибавирин обладает умеренной способностью подавлять репродукцию вир са герпеса. В целом ряде исследовар-NJ-(1QQC2 1. МаН 2. СНзСООСН2СН Т CJ-COOC2H5 3 /метанол СН20СН2СН20СОСНз

Реакцией алкилирования полученного по известной схеме этилового эфира I,2,4-триазол-З-карбоновой кислоты получают промежуточный этиловый эфир 1-(1-ацетоксиэтоксиметилу-1,2, i -триазол-5-карбоновой кислоты, обработка которого полунасьпценным раствором аммиака в метаноле при комнатной температуре приводит к получению целевого продукта, выделяемого известными способами.

Пример 1. Синтез 1-С2-окси.этоксиметил/-,2,4-триазол-5-карбоксамида и его выделение.

К раствору 5,64 г (40 ммоль) этилового эфира 1,2,4-триазол-ЗкарбЛновой кислоты в 160 мл абсоjnoTHoro диметилформамида добавляют

1,16 г (48 ммоль гидрида натрия, перемешивают 30 мин при комнатной температуре fдо прекращения .вьщеления пузырьков водорода) и добавляют

9,16 г (60 ммоль) -ацетоксиэтоксиметилхлорида. Реакционную смесь перемешивают 24 ч при комнатной температуре, упаривают на роторном исп4рителе, добавляют к остатку 100 мл

воды и экстрагируют водный раствор хлороформом. Хлороформный раствор сушат над , раствор фильтруют и упаривают. К полученному остатку добавляют 200 мл разбавленного вдвое

насыщенного при О С раствора сухого аммиака в абсолютном метаноле, выдерживают 48 ч при комнатной температуре и упаривают. Выделение и 592 НИИ предпринимались многократные попытки усилить его противовирусные свойства путем различных химических модификаций,которые, однако, 6 дали желаемого эффекта. Известно также, что способностью подавлять репродукцию вируса герпеса обладает 9-f2-оксиэтоксиметил гуанин (ацикловир. Целью изобретения является расширение ассортимента веществ, обладающих улучшенным спектром противогерпетических свойств. Поставленная цель достигается свойствами нового соединения формулы 1, обладающего активностью против вируса герпеса. Данное соединение содержит в качестве гетероцикла азотистое основание рибавирина, а в качестве аналога пентозного остаткаалкильный заместитель ацикловира. Вещества такого рода на антивирусную активность ранее не исследовались. Способ получения данного соединения основан на известной реакции и осуществляется по следующей схеме 0СН2С1 г-N 1(JUCONH2 СН20СН2СН20Н

очистку препарата осуществляют двумя способами.

Способ А.Остаток растворяют в 50 мл этанола, добавляют 40 см силикагеля Л 40/100 мкм (Chemapol.Чехословакия) , (взятого по объему) и упаривают досуха. Обработанный таким образом силикагель наносят на колонку (4x15 см ) с силикагелем той же степени дисперсности (суммарньй объем силикагеля не более 220 см у. Элюцию проводят смесью хлороформэтанол (линейный градиент от О до 30% этанола, общий объем 2л). Фракции, содержащие соединение I ( элюирующая концентрация этанола 10%, упаривают досуха. Вещество I перекристаллизовывают из этанола, выход 3,35 г, 45 %. .

Способ Б. Остаток растворяют при нагревании в этаноле, оставляют на ночь при комнатной темпера.туре, осадок отделяют, маточный спиртовый раствор упаривают досуха, остаток перекристаллизовывают из этанола. Выход вещества 1 3,19 г, 43%.

Оба способа выделения дают возможность количественного отделения от побочных продуктов.

Физико-химические характеристики соединения 1: т;пл.111-П2 С; ():205 (8600), 215,3 f8600; (Сагу 118, CUIA) ; ПМР-спектр в Т);,0 С(5;:м,д.): Н(3) 8,18 с (Ш), СН2(1 ), 6,01с(2Н),СНг(3) и СНа(4 3,75с (4Н) (спектрометр XL -100-15,

CUIA);

Изучение влияния препаратов на морфологию клеток СУ4

Найдено,%: С 38,61; Н 5,48.

Ct}i,.

Вычислено,%: С 38,70, Н 5,42.

тех. R : 0,58 (.система А); 0,66 (системаВ); 0,57 (система вЛ

Системы для ТСХ: н.бутанол - вода уксусная кислота (5:3:2) (А); изопропанол - аммиак - вода (8:1:1) (Б); хлороформ - спирт (7:3)(в). Пример 2. Определение цитотоксического действия и противовирусной активности 1-Г2-оксиэтоксиметил -1, 2,4-триазол-5-карбоксамида,

Учитывая, что заявляемое вещество содержит в качестве гетероцикла азотистое основание рибавирина, биологическуй активность нового вещества изучали в сравнении с рибавирином

(iCN,craA).

Изучение цитотоксического действия проводили на перевиваемой линии клеток CUf (клетки почек африканских зеленых мартьгаеку. В качестве среды поддержки использовали питательную

среду № 199, содержащую 103 эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, Scofland).

Показано, что соединение I обла.дает значительно меньшим цитотоксическим действием, чем рибавирин. Так, в концентрации 250 мкг/мл он практически не изменяет морфологии клеток в течение 96 ч контакта, в то время как рибавирин в аналогичной концентрации вызьшает 50% токсический эффект.

Данные о влиянии заявленного препарата на морфологию клеток представ.тт.ены в табл, 1.

Т а б л и. ц а

250

Рибавирин

125

60

250

125

Соединение 1

60

1+ 2+

1 +

1+ 1 +

2+

$ 1

Эти данные полностью согласуются .с результатами по изучению влияния препарата на синтез клеточной ДНК. Определение синтеза ДНК проводили по включению Н-тимидина (-СССР, Ленинград, уд.активность 22 кюри/ /ммоль) в кислотонерастворимую фракцию.

Введение соединения 1 в концентрации 250 мкг/мл вызьшало лишь частичСинтез ДНК в культуре клеток CV-t в присутствии Препаратов

Контроль

Рибавирин

(250 мкг/мл) Соединение 1,32х10 М (250 мкг/мл

Примечания: - контроль-клetки,необработанные препаратом;. .контакт с Н-тимидином продолжался I ч при 37 С,

Изучение противовирусной активное- 30 по цитопатическому дейстйию и выти соединения проводили в той же клеточной системе, В качестве инфекхщонного материала использовали вирус простого герпеса I типа; штамм . Множественность инфицирования OjOOl 35 |ИД5о на клетку. Препараты вводили в состав среды поддержки непосредственно после адсорбции вируса. Инфекционный титр вируса определяли

Влияние соединения I на развитие цитопатического действия, вызываемого вирусом простого герпеса в клетках CVi

245594

нее угнетение синтеза клеточной ДНК (44 и 49% ) через 24 и 48 ч инкубации соответственно; в аналогичных условиях рибавирин ингибировал этот про5 цесс на 86% (табл.2); концентрация 125 мкг/мл соединения 1 вызьгоала недостоверное снижение синтеза клеточной ДНК , не превыйающее 15%,

Таблица 2

6,14+0,3

59% 0,87+0,3 86

44% 3,17+0,3 49

ражали в Рд .

Изучение влияния испытуемого соединения на развитие инфекционного процесса в клетках CV-i показало, что во всех используемых концентрациях соединение I задерживает развитие вирусной инфекции.

Данные представлены в табл. 3.

Т а б л и ц а 3

71

Изучение влияния соединения I на накопление инфекционного вируса представлено в табл.4. Очевидно, что испытуемое срединение обладает значительно большей антигерпетической

Обработка вируса герпеса соединением I в рабочих концентрациях практически не снщсает его инфекционное-. Влияние препаратов на репродукцию вируса герпеса

в культуре клеток Cj

Концентрация,

Препарат мкг/мл

125

60 ном

125 нные

60

30

15

7,5 П

8

активностью, чем рибавирин; концентрация 125 мкг/мл снижает титр вируса на 4 9 ГОШда/мА и даже концентрация 7 ,5мкг/млвызьшает достоверное подавление инфекционного титра вируса, ти Стабл. таким образом, испытуемое соединение не обладает вирулицидным действием.

ТаблицаА

Подавление титра вируса, Т1Щ,5р/

МА.

2,5 5,5 4,0 3,5 3,0 2,0 1,5 римечание: Множественность инфицирования 0,001 ИД на клетку. Соединения вводили в среду поддержки непосредственно после адсорбции вируса. Изучение; вирулицидного действия соединения I Вариант Концентрация, Титр вируса, Исходный вирус-7 Вирус (4 ч, )- 6,5 Вирус, обработанный соединением 1 {4ч, 1256,5 Вирус, обработанный соединением 1 (4 ч, 37°С) 62,5 6,5 Т а б л и ц а 5 мкг/мл АгТЦД 50/мл

9112455910

Таким образом, проведенные испы- вирусной активностью и избирательно тания показьгоают, что новое соеди- подавляет репродукцию вируса проснение обладает выраженной противо- того герпеса.