Способ определения активности гемосенситинов Советский патент 1984 года по МПК A61B10/00 

г Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к приготовлению иммунодиагностических препаратов. Известен споеоб определения акти ности гемосенситинов одинаковой специфичности, по величине оптималь ной гемосенситивности дозы препарат или по величине максимального литра реакции пассивной гемаглштинации -РПГА l . Однако, известный способ недостаточно точен, поскольку препараты сенситина обладают неодинаковой способностью связывать гамеглютинирующий элемент (антитело или антиген) . Известен также способ определени активности гемосенситинов одинаковой специфичности, включающий измерения антителосвязывающей активности сенситина, сенстабилизацию эритроцитов и расчет печальной скорости сенсибилизации 2j . Однако этот способ также недостаточно точен, поскольку по оценке сказывается неодинаковая способность различных препаратов сенситина одной специфичности связывать гемсанлютипи рующий агент, которая не имеет отношения к собственно гемсенситивной активности. Целью изобретения является повышение точности способа ; Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения активности гемосенситинов одинаковой специфичности, включающему измерение антителосвязывающей или антигенсвязы.вающей активности сенситина, сенсибил зацшо эритроцитов и расчет начальной скорости сенсибилизации,сенсибилиза цию эритроцитов осуществляют равноэф фективными по связыванию дозами сен- ситина. Способ осуществляется следую1цим образом. Любым количественным методом (например, при помощи реакций нейтрализации или торможения пассивной гемагглютинации) измеряют антителосвязывающую активность антигена сенситина или антигенсвязывающук активность антител-сенситина. Сравниваемые препараты сенситина разводя до равноэффективной по связыванию антител (или антигена) концентрации После этого эритроциты сенсибилизируют каждый из сравниваемых препаратое, взятым в равноэффективной по связыванию гемагглютинирующего агента концентрации, в течение различного времени при прочих (температура, рН среды и т.п.) одинаковых условиях. Сенсибилизированные эритроциты отмывают при центрифугировании забуференным (рН 7,0-7,2) 0,85%-ным раствором хлористого натрия (при необходимости со стабилизатором) и определяют уровень их сенсибилизации - титр РПГА при использовании одного и того же препарата гемагглютинирующего агента; Затем, исходя из характера зависимо-v сти титра РПГА от длительности сенсибилизации, рассчитывают значения начальной скорости сенсибилизации по ранее разработанному методу. Более активным гемосенситином является тот препарат, у которого значение начальной скорости сенсибилизации выше. Пример 1. Сравнивали гемосенситивнзто активность двух серий антигенных препаратов, вьщеленных из Senteritidis. Их оптимальные гемо сенситивные дозы, определенные по известному способу, оказывались одинаковыми - 8 мкг/л, а максимальный титр РПГА существенно не различался для первого препарата он был равен ,1:51200, для второго - 1:64000. Определение коэффициента относительной гемосенситивной активности также дало весьма близкие значения для препаратов двух серий - 2,9-2,0. Определение известным способом значений начальной скорости сенсибилизации препаратами, взятыми в эквивалентных по выходу дозах (выход 1-го и 2-го препаратов из сухой микробной массы соответственно равен 11,9 и 9,1%), показало практически одинаковую активность (значения скорости равны соответственно 1120 и 1200). Таким образом, все известные способы не позволили выбрать .лучший из двух препарат гемосенситина. По предлагаемому способу осуществили необходимые операции в такой последовательности. Вначале определяют дозы сравниваемых препаратов, вызывающие торможение пассивной гемагглютинации в 2 раза. Они оказались равными 0,023 т 0,016 мгк/л для первого и второго препаратов соответственно. Эритроциты нагружают антигенами в равно3112891А4

эффективных по связыванию антител длительности нагрузки - при этом дозах (0,92 и 0,64 мкг/л соответст- получили следующие результаты венно), Измеряют титр РПГА при разной (табл. 1).

Таблица

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГЕМОСЕНСИТИНОВ одинаковой специфичности, включающий измерение антителосвяг .зывающей или антигенсвязывающей актив.пости сенситина, сенсибилизацию эритроцитов и расчет начальной скорости сенсибилизации, отличающийс я тем, что, с целью повышения точности способа, сенсибилизацию зритроцитов осуществляют равнозффективными по связыванию дозами сенситина.

4000

4800

4000

4800

11200

11200

16000

16000

19200

16000

22400

22400

Не измеряли

180

Начальная скорость се н си били 3 ации

НЕ .доверительный интервал

Различие значений начальной скорости сенсибилизации

38400 32000 32000 38400 44800 44800 44800 44800 44800 64000 64000

44800

51200

64000

51200

51200

64000

64000

64000

64000

8120 6400Р 0,001

Затем расчитьгоают значения Haiianbной скорости сенсибилизации следующи образом: корреляционный и регрессионный анализ связи между обратными значениями титра РПГА (1/У) и экспозиции (1/Х) позволил определить значения коэффициента регрессии 1/У по 1/Х. Они равны 0,002058 (для первого препарата) и 0,0001232 (для второго препарата). Отсюда значения начальной скорости сенсибилизации (величина, обратная значению коэффициента регрессии) оказались равными 486 и 6126 соответственно. Таким образом, предлагаемый способ выявил существенные преимущества антигена второй серии погемосенситивным свойствам.

Приготовление эритроцитарных диагностикумов в полупроизводственно объекте из антигенных препаратов двух серий дало следующие результаты Максимальный титр РПГА с диагностикумами составили 1:44800-1:51200 (для первого антигена) и 1:64000-1:76800 (для второго антигена). Известный - по величине оптимальный сентивной дозы, мкг/мл Известный - по величине максимального титра РПГА Известный - по коэффициенту относительной гемосенситивной активности Известный - по величине начальной скорости сенсибилизации для эквивалентных по выходу концентраций Предлагаемый - по величи начальной скорости сенси билизации равноэффективн по антителесвязыванию я дозами

Длительность нагрузки, необходимой для достижения такой чувствительности, составил 2-3 ч (для первого антигена) и только 10-30 мин (для второго антигена). Характеристика чувствительности диагностикумов из антигенов двух серий продемонстрировала, таким образом, лучшие гемосенситивные свойства второго препарата, что проявилось в некотором повышении чувствительности РПГА и значительном (в 4-18 раз) сокращени длительности сенсибилизации эритроцитов.

Данный пример показывает, что предлагаемый способ позволит дать более точную количественную оценку гемосенситивной активности антигено по сравнению с известными.

Пример 2. Аналогичным образом (известным и предлагаемым) сравнивали гемосенситивную активность двух серий антигенов Е. Coli 011184. Результаты приведены в табл. 2.

Таблица2 7 112891 Видно, что при использовании всех известных способов различия между двумя сериями антигена обнаружены не были. Предлагаемый способ показал почти трехкратное преимущество,пер- s вого антигена по гемосенситивной активности. Приготовление полупроизводственных серий эритроцитарных диагностикумов из антигенов двух серий в дозе 10 200 мкг/мл показало, что чувствительность диагностикума из сенситина первой серии составила 1:102400, а из второго - 1:51200. Необходимая длительность сенсибилизации при 15 испоЛБЗовании первого антигена соста48вила 30 мин, а второго - 2-3 ч. Эти данные подтверждают лучшую гемосенситивную активность первого антигена, что бьшо выявлено только с помощью предлагаемого способа, . Таким образом, предлагаемый способ, в отличие от известных, дает возможность более точной оценки активности гемосенситинов, независимо от различного сочетания характеристик активности, измеренных по известным способам, что важно для правильного выбора сенситина, ипользуемого при изготовлении эритроцитарных диагностикумов.