Реагент для идентификации вибрионов Советский патент 1984 года по МПК C12Q1/04 

1

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано для лабораторной диагностики холеры.

Известен реагент для идентификации вибрионов, состоящий из высушенного бумажного носителя, пропитанного смесью пленкообразующего стабилизатора и индикатора .

Однако известный реагент позволяет провести только качественный анализ и усложняет его проведение.

Цель изобретения - упрощение колчественного определения холерных вибрионов.

Указанная цель достигается тем, что в реагенте для идентис1)икации вибрионов, состоящем из высушенного бумажного носителя, пропитанного смесью пленкообразующего стабилизатора и индикатора, в качестве носителя используют хроматографическую бумагу, которую пропитывают средой, содержащей сахарозу, желатину и индкатор, взятьк в соотношении 8-10%, 1-1,5% и 88,5-91%, при этом в качестве индикатора используют, диагностическую сыворотку О, Огава или Инаба, или диагностический холерный фаг С или Эль Тор.

Реагент приготовляется следующим образпм.

Хроматографическую бумагу предварительно обрабатьшают сахарозо-желатинозной средой (8-10% и 1-1,5% соответственно) . Растворы диагностических сывороток (в физиологическом растворе рН 7,2-7,4) и фагов (в защитной сахарозо-желатинозной среде) готовят с учетом получения конечных разведений при постановке реакций агглютинации и фаголизиса в титровании. Высушивание систем проводят лиофильно.

Пример 1. Для приготовлени систем диагностических серологических в качестве носителя используют стерильную хроматографическую бумагу 5 X 10 см, предварительно обработанную сахарозо-желатинозной средой (10% и 1% соответственно), в количестве 1 мл и подсушенную при 37+1®С в течение 40 мин. Подготовленные листы бумаги указанного размера пропитывают в кюветах двухкратными разведениями (1:2, 1:4, 1:8, 1:16 и т.д.) специфических холер ных сывороток О, Инаба, Огава в физиологическом растворе рН 7,2 в

92352

количестве 1,3 мл каждого разведения на лист. Количество вносимьк в бумагу сывороток рассчитывают с учетом получения титров антител, участвующих в реакции агглютинации (в соответствии с рекомендациями инструкции). Через 20 мин листы бумаги покрывают стабилизатором - пленкообразующим полимерным покрыQ тием - 1% поливиниловым спиртом в количестве 0,7 мл и спустя 20 мин помещают в морозильный шкаф при на сутки. Лиофилизацию проводят на протяжении 24 ч при остаточном давлении 100 мкм. Температура конденсатора . Начиная с четвертого часа для идентификации процесса вводят дополнительный подогрев до температуры в камере 31°С. Повьшение температуры не должно превьш1ать 4 в час. После лиофилизации бумагу нарезают в виде дисков диаметром 1 см. Полученные указанным способом диски с холерными агглютинирующими сы- воротками используют для постановки количественной реакции методом агглютинации.

В ряд стерильных пробирок фломбированным пинцетом помещают по одному диску, содержащему по 0,02 мл сьгеоротки соответствующего разведеУИЯ (1:2, 1:4, 1:8 и т.д.). В пробирки с дисками заливают по 0,5 мл стерильного физиологического раство ра (рН 7,2) таким образом, чтобы

5 они были полностью погружены в жидкость. Пробирки выдерживают 30 мин В термостате для наиболее полного элюирования антител в физиологический раствор. Таким образом,в элюирую щем растворе сыворотки разводят в 25 раз (1:50, 1:100, 1:200 и т.д.). Затем во все пробирки вносят по 0,5 мл одномиллиардной взвеси смыва суточной агаровой культуры исследуе5 мых штаммов (используют -два музейных . штамма холерных вибрионов V. cholerae № 145, серотип Инаба и V. cholerae № 1409, серотип Огава), т.е. сьшоротки разводят еще в 2 раза, полу0 чая конечные разведения 1:100, 1:200, 1:400 и т.д., до титра сьтороток. Пробирки встряхивают, ставят на 2 ч в термостат при 37С и затем предварительно учитывают реакцию. Оконча5 тельный учет производят через 18 ч вьщерживания пробирок при комнатной температуре по четырехкрестовой системе. 3 Результаты постановки реакции агглютинации с помощью бумажных,тестсистем серологических и классическим методом идентичны: через 2 ч наступает четкая на 3-4 креста агглютинация Vibrio cholerae № 145 с сьшоротками О и Инаба до их титра, а Vibrio cholerae № 1409 - с сыворотками О и Огава. Результаты количественного определения антител по белку (методом Лоури) представлены в табл. 1. Пример 2о Для приготовлени систем диагностических фаговых стерильную хроматографическую бумагу 5 X 10 см обрабатывают сахарозо-же- латинозной средой (10% и 1,5% соответственно) в количестве 1 мл, затем подсушивают в течение 40 мин при . Подготовленные листы бумаги пропитывают холерными диагностическими монофагами С (классическим) и Эль Тор в объеме 1,2 мл, исполь зуя цельные и десятикратные ( , 10, до рабочего титра ) разведениЯ в сахарозо-желатинозной среде (10% и 1,5% соответственно). 354 Через 20 мин листы бумаги покрывают стабилизатором - пленкообразующим полимерным покрытием - 1% поливиниловым спиртом в количестве О,7 мл и спустя 20 мин помещают в морозильный шкаф при на сутки. Лиофилизацию проводят на протяжении 24 ч при остаточном давлении 100-200 мкм. Температура конденсатора -40°, начиная с четвертого часа для интенсификации процесса вводят дополнительHbiii подогрев до температуры в камере ,31°С. Повышение температуры не должно превьппать 4 в час. После лиофи1изации бумагу нарезают в виде дисков диаметром 1 см. Диски с холерными фагами используют при определении фагочувствительности двух музейных штаммов холерных вибрионов (vibrio cholerae № 1409 и Vibrio cholerae № 888). Сравнительная характеристика серологических (холерных О)диагности- ческих тест-систем в дисках, приготовленных по прототипу и предлагаемому способу приведены в табл. 1, Таблица

РЕАГЕНТ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИБРИОНОВ, состоявший из высушенного бумажного носителя, пропитанного смесью пленкообразующего стабилизатора и индикатора, отличающийся тем, что, с целью упрощения количественного определения холерных вибрионов, в качестве носителя используют хроматографическую бумагу, которую пропитьшают средой, содержащей сахарозу, желатину и индикатор, взятых в соотношении 8-10Z, 1-1,5% и 88,5-91%, при этом в качестве индикатора используют диагностическую сыворотку О, Огава, или Инаба, ипи дагагностический холерный фаг С или Эль Тор.

Сушка при +80С приводит к разрушению Данные приведены при сушке 37°С.

В две чашки. Петри разливают по 18-20 мл питательного щелочного агара рН 7,6. После застыйания и подсушивания агара в течение 30 мин при 37+l C дно чашек расчерчивают на квадраты по количеству используемых разведений диагностических фагов. На каждую из чащек наносят слой 0,6% расплавленного и остуженного

дениях до ра-. бочего титра (срок наблюдения)

питательного агара рН 7,6 (5 мл), содержащего 0,2 мл взвеси смыва суточной агаровой или двухчасовой бульонной исследуемой культуры. Затем в каждую чашку на поверхность агара помещают диски, содержащие холерные фаги С (классический) и Эль Тор в разведениях. После подсушивания с приоткрытыми крышками иммуноглобулина (антитела) .

5 V 1

при комнатной температуре в течение 30 мин чашки инкубируют в термостате при 37+14.

Предварительный учет результатов реакции проводят через 4 ч, окончательный через 18 ч. Наличие ореола лизиса вокруг диска при четком выявлении газона культуры на чашке оценивают как положительный результат. Четкий лизис V. cholerae № 888 наблюдают через 4 ч инкубирования в термостате, а лизис V. cholerae

Способ приготовления дисков

Прототип

10-V 10-3 Предлагаемый

Сушка при приводит к гибели фаговых частиц.

. Данные приведены при сушке Среда для сохранения и выхода специфических антител и кор hycKyn фагов подобрана в onbfтах с применением различных кон k;eнтpaций сахарозы и желатина, растворенных в дистиллированной воде.

292356

№ 1409 через 18 ч. Результаты идентичны результатам при постановке реакции классическим методом и с помощью систем диагностических фаго5 вых. Количество живых фаговых частиц в дисках проверяют методом Грациа (табл. 2).

Сравнительная характеристика фаговых холерных Эль Тор диагностических тест-систем в дисках, приготовленных по прототипу и предлагаемому способу приведены в табл. 2.

Таблица 2

Срок хранения

0, 3 мес

0,8-10 1,5 года в рабочих

разведениях (срок наблюдения) - Оптимальные результаты по всем использованным диагностическим препаратам получены со средой, содержащей 8- 10% сахарозы и 1,0-1,5% желатина. В табл. 3 приведены средние данные из 10 опытов достигаемого эффекта по отношению к прототипу.

п)

а

S

с ю

п) Н

9112923510

Предварительная пропитка хроматог-постановке реакций агглютинации и фарафической бумаги сахарозо-желатиноз-голизиса, Лиофильное высушивание и

ной средой обеспечивает наиболеепредварительная пропитка сахарозополный выход из диска специфическихжелатинозной средой предотвращает

антител и фаговых корпускул. 5гибель антител и фаговых корпускул

-Г;.и позволяет сохранять эти системы

:- Различное содер7 а|ше в системахв течение 1,5 лет для фагов (срок

антител и фаговыз VapTHU позволяетнаблюдения) и 2 лет для сывороток

проводить количественный анализ при(срок наблюденияV.