Способ определения противостафилококковой антитоксической активности сыворотки крови Советский патент 1985 года по МПК A61B10/00 

Фиг. 1 Изобретение относится к области медицины, а именно к бактериологии. Известен способ определения антитоксической активности сыворотки кро ви по В.Г.Выгодчикову, основанный на нейтрализации испытуемой сьшороткой гемолитических свойств стафилококкового токсина ClJ. Однако известный способ недостаточно точен и при постановке занимае много времени (4,5 ч), поскольку является полуколичественным и позволяе определять интервалы определяемой ак тивности лишь в пределах 1-2 АЕ для высоких титров и 0,25-0,5 АЕ для минимальных титров антитоксической сыворотки. В клинике зачастую антитоксическая активность сыворотки превышает эти пределы и требуется дополнительное определение, Целью изобретения является повышение точности способа и сокращение времени определения противостафилококковой антитоксической активности сыворотки. Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения противостафилококковой антитоксической активности сыворотки крови путем определения степени нейтрализации последовательных разведений токсина испытуемой сывороткой по гемолизу эритроцитов, реакцию гемолиза останавливают через 12 мин инкубации рас твором глютаральдегида, неразрушенные эритроциты осаждают, а степень гемолиза в надосадочной жидкости определяют с помощью фотоэлектрокалориметра по величине антитоксической активности сыворотки по калибровочным кривым Способ осуществляется следующим образом В трех пробирках разводят три ток сина различной силы. Для этого стандартный токсин с известной силой LH доводят до титра, указанного на этикетке (берется количество токсина,

экстинкция надосадочной .жидкости , экстинкция надосадочной жидкости и осадка

X 100%. 62 соответствующее его LH и доводится до I мл физиологическим раствором). Из основного раствора токсина готовят три его разведения, для чего к 5 мл физиологического раствора добавляют 2 мл токсина (первое разведение 0,4 LH), 0,5 мл токсина (второе разведение 0,1 LH) и 0,2 мл токсина (третье разведение 0,04 LH). Испытуемую сыворотку в количестве 0,15 мл разводят в два раза физиологическим раствором (рН 7,4). Эритроциты кролика, дважды отмытые физиологическим раствором, разводят 1:2. В три пробирки добавляют по 1 мл различных разведений токсина, по 0,1 мл испытуемой сыворотки и по 0,1 мл разведённых эритроцитов. Пробирки немедленно помещают в водяную баню при 37°С. Через .12 мин гемолиз эритроцитов останавливают путем добавления в каждую пробирку по 0,1 мл О,15%-ного раствора глютаральдегида. Время инкубации подобрано опытным путем, как наиболее оптимальное. Пробирки центрифигируют в течение 5 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в три пробирки, содержащие по 2 мл 0,1 и. раствора соляной кислоты. К осадку добавляют по 4 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты. Во всех пробирках образуется стойкий раствор хлоргемина, насыщенность которого измеряют с помощью фо- тоэлектроколориметра (ФЭК) с использованием светофильтра (6). В связи с тем, что концентрация стандартных эритроцитов может несколько отличаться в различных исследованиях и даже в отдельных пробирках, за 100% гемолиза (контроль) принимается сумма экстинкции раствора хлоргемина в осадке и надосадочной жидкости каждой пробы. Это еще больше повышает точность предлагаемого способа. Затем рассчитывают процент гемолиза эритроцитов в надосадочной жидкости по следующей формуле:

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТИВОСТАФИЛОКОККОВОЙ АНТИТОКСИЧЕСКОЙ АК% гемо/гиз эр. 60 40 20 ТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ путем определения степени .нейтрализации после-, довательных разведений токсина испытуемой сывороткой по гетяолизу эритро цитов, о тлич ающий ся тем, Что, с целью повышения его точности, и сокращения времени определения, реакцию гемолиза останавливают через 112 мин инкубации раствором глютаральдегида, неразрушенные эритроциты осаждают, а степень гемолиза в над ;рсадочной жидкости определяют с помош;ью фотоэдектрокодориметра по величи не антитоксической активности сыво ротки по калибровочным кривым. (/) ОО 00 Токсин J ГС О

По калибровочной кривой определяют антитоксическую активность испытуемой сыворотки в антитоксических единицах

(АЕ). Полученный результат следует удвоить, так как сыворотка была разведена в два раза. С целью ускорения метода после центрифугирования трех пробирок для растворения в соляной кислоте и последующего колориметрирования выбира ется лишь одна пробирка, в которой гемолизировалась лишь часть эритроцитов. Например, при высокой антиток сической активности сыворотки (2,25 9,0 АЕ) в первой пробирке (токсин 0,4 LH) гемолиз частичный, во второй ( токсин 0., I LH) и в третий (токсин 0,04 LH) пробирках гемолиза нет. При средней антитоксической актив ности сыворотки (0,56 - 2,25 АЕ) в первой пробирке гемолиз полный, во второй - гемолиз частичный, в третий гемолиза нет. При низкой антитоксической активности сьшоротки (0,14 0,56 АЕ) в первой и второй пробирках гемолиз полнЬ1Й, в третьей - частичный. Поскольку разница в суммарной оптической плотности осадка и надосадочкой жидкости в различных опытах колеблется в незначительных пределах для еще большего ускорения метода возможно определение экстинкции лишь надосадочной жидкости, а расчет степени гемолиза производится из расчет средней суммарной экстинкции осадка и надосадочной жидкости, равной в наших исследованиях 1,2. ; Калибровочные кривые построены на основании изучения степени гемолиза эритроцитов, вызванного смесью стафилококкового токсина с различными

0,60 (экстинкция надосадочной жидкости) 0,60 (экстинкция надосадочной жидкости) +

По второй калибровочной кривой, построенной для второго токсина, активность сыворотки крови больного г, 0,525;2 1 ,05 АЕ (результат удвоен, так как сьгооротка разводилась в два раза). Время осуществления способа 40 мин.

При очень высокой активности испытуемой сыворотки (более 9-10 АЕ),что встречается крайне редко и видно по отсутствию гемолиза со всеми тремя токсинами, сыворотку надо развести н в два, а в четыре раза.

Увеличение времени инкубации, например, до 13 мин недопустимо, так

-100% 50 %.

как при низких значениях антитоксической активности испытуемой сыворотки (менее 0,4 АЕ) гемолиз будет полным в смесях во всеми разведениями токсина, что сделает невозможньм определение степени завершенности реакции и антитоксической активности. Уменьшение времени инкубации, например, до 1I мин приведет к сокращению интервала одномоментно определяемой антитоксической активности сывороток от 9 (при 12 мин инкубации) до 3-4 АЕ (при II мин инкубации). Так, например смесь любого из трех токсинов (даже самого сильного) с сывороткой 5 АЕ 26а разведениями противостафилококковой стандартной сыворотки (Центрального контрольного института) с известной антитоксической активностью: 4,5; 3,0; 2,25; 1,125; 0,56; 0,28; 0,14; 0,07 АЕ. Токсин 1 смешивают с сыворотками активностью 4,5; 3,6; 2,25; 1,125 АЕ; токсин 2-е сыворотками 1,125; 0,56; 0,28:АЕ; токсин 3-е сыворотками 0,28; 6,14; 0,07 АЕ (фиг. 1-3). Пример 1. 0,15 мл сыворотки больного Г. разводят в два раза фи- . знологическим раствором и разливают по 0,1 мл в три пробирки, в каждую из которых добавляют по 0,1 мл различных разведений токсина и по 0,1 мл отмытых эритроцитов кролика. Через 12 мин инкубации при 37°С гемолиз эритроцитов останавливают раствором глютаральдегида. Неразрушенные эритроциты осаждают центрифугированием. Надосадочную жидкость переносят в три пробирки, содержащие по 2 мл О,I н. раствора соляной кислоты. Осадок в каждой пробирке растворяют в 4 мл О,1 н. раствора соляной кислоты. Эксинкцию надосадочной жидкости и осадка. измеряют на ФЭКе. Поскольку в первой пробирке гемолиз полный, а в третьей пробирке гемолиза, нет, то для дальнейшего анализа используют вторую пробирку (гемолиз частичный). Процент гемолиза эритроцитов в надосадочной жидкости во второй пробирке следующий: 0,59 (экстинкция осадка)

гемолиза не даст, что также сделает невозможным определение антитоксической активности

Из таблицы видно, что АЕ сьшоротки 6,4f Хак как в пробирках с токсинами О,ILH и 0,04LH гемолиза нет то для рпредепения используется лишь пробир-35 ка с токсином 0,4LH, где гемолиз частичный. АЕ сьшоротки 1,4. Так как в пробирке с токсином 0,4LH гемолиз полный, а в пробирке с токсином 0,4LH гемолиз отсутствует, то для определения используется лишь пробирка с токсином О,1LH, где гемолиз час-, тичный. АЕ сьшоротки 0,28. Так как в пробирках с токсином О,4LH и 0,1LH гемолиз полньй, то для определения используется лишь пробирка с токсином 0,04Ш, где гемолиз частичный.

По известному способу можно получить лишь дискретные значения антитоксической активности сыворотки: 0,125; 0,25; 0,5; 1,0 АЕ (по 1-й схеме) и 2,0; 3,0; 4,0; 6,0; 8,0 и т.д. (по 2-й схеме) По предлагаемому способу возможно получение любых непрерывных значений АЕ на всем измеряемом диапазоне. Так, например, по известному способу АЕ сывороток (таблица) равнялась бы 6,0; 1,0; 0,25 АЕ, что

1138126

В таблице даны примеры использования конкретных сывороток и токсинов с определенной LH,

является менее точным результатом, по предлагаемому способу соответственно - 6,4; 1,4; 0,28 АЕ.

Предлагаемый способ определения противостафилококковой антитоксической активности сыворотки крови объективен, поскольку определяется не только наличие, но и степень гемолиза, и делается это не визуально, а с помощью ФЭКа,

Способ позволяет устранить дискретность получаемых значений антитоксической активности сыворотки крови, что достигается посредством использования калибровочных кривых.

Значительно расширяется диапазон одноэтапно измеряемой антитоксической активности сыворотки, так как по , предлагаемому способу можно при одной постановке реакции определить антитоксическую активность сыворотки до 9 АЕ (в отличие от 1 АЕ по известному способу

Большое значение имеет значительное, сокращение времени (до 40 мин) осуществления способа, что достигнуто тщательной подборкой соотношений кон711381268

центраций токсина, сьшоротки и эрит- позволяет быстро и точно получнть

роцитов. Постановка метода требует :также меньшего количества сыворотки, чем по известному способу. Все это

%гегю/и/з эр. 80

во

40 20

0.5

iotSftQA

эр-moS ВО

2Q

ДГО,2

цифровое значение антитоксической активности испытуемой сыворотки крови.

Тонсин 2

W

АЕ

Фиг.2

TmcvHif

ДЗ АЕ

Ф&г.З