Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата Советский патент 1988 года по МПК C12N9/58 

Изобретение относится к производству ферментных препаратов, в частности молокосвертывающего фермента, путем культивирования сапрофитного дереворазрушающего базиднального гриба Hirschioporus laricinus (Karst,) RyU.Ha жидкой питательной среде. Полученный ферментный препарат может быть использован в качестве замени- теля сычужного фермента - реннина, при производстве твердых сыров.

Целью изобретения является повьпие ние активности целевого продукта и упрощение процесса,

Способ состоит в следующем.

1Чтамм Hirschioporus laricinus ВКП F-263 (М-81) культивируют на каждой питательной среде следующего состава г/л:

Глюкоза10,0

Пептон3,0

,4

КН РОд0,6

7H,jO0,5

ZnS04l-7H200,001

CaClj0,05

Дистиллированная вода до 1 л.

Питательную среду разливают в конические колбы и стерилизуют в авто- клаве под давлением 1 атм в течение 40 мин. Кислотность среды после стерилизации составляет 4,5-5,5 рН. Посевной мицелий выращивают на агари- зированной глюкозокартофельной среде сусло-агаре и на жидкой питательной среде. Инкубируют штамм М-81 в термостате TG-80M при 30°С.

Максимальная: молокосвертывающая активность у ттамма М-81 на среде с глюкозой наблюдается на 10-15 сут роста, затем несколько снижается и к 30 сут падает в 3 раза.

Осаждение белков по фракциям из культурального фильтрата осуществляю путем увеличения концентрации сернокислого аммония на 10%. Фракцию белка, выпавшую в осадок, отцентрифуги- ровывают на рефрижераторной центри- фуге в течение 15 мин при 4-5 С и подвергают первичной очистке с помощью диализа против охлажденной дистиллированной воды в холодильнике в течение 18 ч. В качеЬтве полупрони-; цаемой мембраны используют целлафано вую пленку, поры которой пропускают вещества с молекулярным весом до 7000-10000,

Белки, обладаю1чие молокосвертываю- щей активностью, подвергают дальнейшей очистке с помощью метода электрофореза в параллельных пластинках полиакрил амидно го геля. Полученный водорастворимый белок вносят в количестве О,1 МП в каждую ячейку верхнего геля. Их в приборе 46, Для электрофо- ретического разделения белков используют 7,5%-ный щелочной гель, В щелочном геле белки мигрируют к аноду, поэтому нижний электрод камеры подключают к гнезду выпрямителя (УИП), имеющему знак плюс(+). Верхний электрод присоединяют к знаку минус (-), ,В начале электрофореза, до вхождения индикаторной краски в разделякяций гель, поддерживают ток 80 мА при напряжении 210 В. атем повьшают ток до 180 мА при напряжении 470 В, Заканчивают фракционирование белков при подходе индикаторной краски к нижнему краю разделяющего геля. Электрофорез длится примерно 3 ч. Затем сняв боковые стекла прибор.а, срезают концент рирующий гель и вынимают из кювет пластинки разделяющего геля, Для определения злектрофоретической подвижности молокосвертывающего фермента отрезают три ячейки разделяющего геля и фиксируют 7%-ным раствором трихлор- уксусной кислоты в течение 20 мин. Затем отмывают гель от трихлоруксус- ной кислоты дистиллированной водой (трижды по 10 мин) и окрашивают в течение ночи в 0,02%-ном растворе красителя Кумасси ярко-голубой Г-250, приготовленного в смеси этиловый спирт - вода - уксусная кислота (10:30:1), Избыток красителя отмывают раствором, состоящим их этой же смеси растворителей, Отмытьй от красителя гель используют для определения относительной электрофоретичес- кой подвижности зон молокосвертывающего фермента и служит эталоном для выявления локализации фермента в пластинках геля, не подвергшихся фиксации и окраске красителем. Отмытый гель накладывают на пластинки разделяющего геля и отмечают место нахождения зон молокосвертывающего фермента, которые вырезают, объединяют, замораживают и растирают в ступке. Растертую массу заливают холодной дистиллированной водой для экстракции белков, которая длится в течение 2- 3 ч. Затем гомогенат центрифугируют

в центрифуге (8000 об/мин) при в течение 15 мин. Надосадочную жидкость сливают и подвергают лиофиль- ной сушке. Полученньй препарат имеет вид порошка светло-кремового цвета, хорошо растворимого в воде. Молоко- свертывающая активность этого препарата составляет 1700000 ед/г.

Пример. Выращивание штамма М-81 осуществляют в конических колбах на 1 л, содержащих 300 мл сте- ральной глгокозопептонной среды с рН 4,5-5,5 в термостате при 30 С поверхностным способом в течение 10 сут. Культуральный фильтрат отделяют от мицелия путем фильтрования через бумажный фильтр (синяя лента). Затем, фильтрат охлаждают в холодильнике до 4 с и осаждают ферментный препарат сернокислым аммонием. Молокосверты- вающий фермент находится во фракции белка, осаждаемой от 55 до 80%-ного насып;ения фильтрата сернокислым аммонием. Выпавший в осадок белок центрифугируют и диализируют против охлажденной дистиллированной воды в холодильнике в течение 18 ч. Затем диа- лизируемую смесь переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 15 мин. Полученная надосадочная жидкость содержит молокосвертывающий фермент, ко- торьй подвергают дальнейшей очистке методом электрофореза в параллельных пластинах полиакриламидного геля. Надосадочную жидкость сливают и подвергают лиофильной сушке. Полученный препарат имеет вид порошка светло- коричневого цвета, хорошо растворимого в воде. Нолокосвертывающая активность этого препарата составляет 1700000 ед/г.

Молокосвертывающая активность ферментного препарата определяют по методике, предложенной Каваи и Мукаи. Для этого в 100 мл натурального молока вносят 1 мл 15%-ного раствора СаС, тщательно перемешивают и доводят кислотность субстрата с помощью 10%-ного раствора НС1 до 6,0-6,1 рН. Затем берут по 10 мл молока в пробирки и нагревают в водяной бане до . После этого в каждую пробирку добавляют 1 Мл 0,1%-ного водного раствора ферментного препарата. Смесь в пробирках встряхивают и снова ставят в водяную баню при . В момент встряхивания пускают секундомер

и начинают отсчет времени, который заканчивают при появлении в пробирках плотного сгустка. Время, затраченное на образование сгустка, условно считают молокосвертывающей активностью, выраженной в минутах.За единицу моло- косвертывакнцей активности принимают количество фермента, необходимое для свертывания 100 мл молока за 40 мин при 35 С и рассчитывают по формуле.

0

5

МСА где К

ед/г,

5

40 об 5

4о 1од К

препарата t - oi - коэффициент разведения препарата фермента;

t - время, в течение которого из 100 мл молока при добавлении 1 мл, 0,1%-ного раствора фермента образуется штЬтный сгусток, мин;

среднее время свертывания молока при производстве сыра, мин;

навеска ферментного пр епара- та, в г.

Для осаждения молокосвертывающего фермента из культурального фильтрата используют сернокислый аммоний обладающий стабилизирующим действием на ферменты и все операции по выделению и очистке молокосвертывакяцего препарата не требуют отрицательных низких температур.

Культуральный фильтрат штамма М-81 Hirschioporus laricinus патогенными токсичными свойствами по отношению к беспородным белым мьппам обоего пола не обладает.

40

Формула изобретения Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата, предус матривающий поверхностное культивирование продуцента Hirschioporus lari45 cinus ВКИМ F-263 на глюкозопептонной питательной среде до достижения максимальной активности, отделение мицелия фильтрованием, осадцение фермента сернокислым аммонием и очистку,

50 отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта и упрощения процесса, фильтрат охлаждают до 4-5 С, осаядение ведут при 55-80%-ном насыщении, а очи55 стку - сначала диализом против охлажденной дистиллированной воды при 4- 5 С, затем методом электрофореза в параллельных пластинах полиакриламидного геля.

Изобретение может быть использовано в пищевой промышленности для изготовления твердых сыров. Цель изобретения - повышение активности целевого продукта и упрощение процесса за счет использования активного продуцента гатамма М-81 сапрофитного де- реворазрушающего базидиального гриба Hirschioporus laricinus ВКПМ F -263, культивируемого на глюкозопептонной среде, охлаждения её до температуры 4-5°С, осаждения фермента сернокислым аммонием при 55-80%-ном насыщении с последующей его очисткой от . низкомолекулярных веществ и белков, не растворимых в .воде, методом r ta- ЛИЗ а против охлажденной дистилл11ро- ванной воды при температуре и дальнейшей очисткой фермента методом электрофореза в параллельных пластин- ках полиакриламидного геля. Активность ферментного препарата 1700 000 ед/г. I (Л