СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕФАЛОСПОРИНА С Российский патент 1997 года по МПК C12P35/00 C12P35/06 C12P37/00 

Изобретение относится к способам ферментативного получения цефалоспорина С с помощью Acremokium chrisogenum.

Переработку содержащих антибиотики культуральных бульонов осуществляют, как правило, после достижения максимального содержания. В большинстве случаев в качестве первой стадии осуществляют отделение клеток и твердых веществ путем фильтрации или центрифугирования, после чего можно осуществлять обогащение ценного вещества путем экстракции или адсорбции.

Очищенный продукт затем, как правило, кристаллизуют и он может быть далее переработан в полусинтетические антибиотики.

При этом постадийном способе обращает на себя внимание в отрицательном плане нестабильность многих молекул антибиотиков, как, например, цефалоспорина С (СРС).

Уже во время ферментации происходит разрушение СРС, которое может происходить как чисто химически путем воздействия воды на β-лактамное кольцо, так и также при помощи ферментов, например, при помощи эстераз (Конесни и др. f.o Antb. 26, 3, 135 141). Далее при ферментации образуется ряд побочных продуктов, таких как деацетоксицефалоспорин С (ДОСРС) и деацетилцефалспорин С (ДСРС), которые при очистке должны быть от СРС. С этим связаны значительные потери в выходе. Фильтрационные системы в поперечном потоке (Cross-flow) с полимерными или керамическими мембранами уже применяют для переработки бульонов антибиотиков (Harris и др. f. Chem. Techn. B o-techn. 1988, 42, 19 30).

До сих пор не обнаружено, что при этих способах может быть уменьшено разложение цефалоспорина С. Известно выделение цефалоспорина С после ферментации с помощью фильтрации в поперечном потоке (M. Kalyanpus и др. Contribuyed Paper, гл. 32, с. 455 470, прототип).

Задача изобретения разработка способа, с помощью которого можно уменьшить разрушение цефалоспорина С и образование побочных продуктов, а также повысить выход в расчете на вводимое количество субстрата.

В настоящее время неожиданно было найдено, что благодаря применению фильтрационного модуля в поперечном потоке во время ферментации Arcemonium chrysogenum можно повысить выход СРС, уменьшить образование ДСРС и продлить время продуцирования. Кроме того, благодаря фильтрации и незначительному образованию ДСРС существенно упрощается переработка цефалоспорина С.

Изобретение относится к способу получения СРС, который отличается тем, что ферментационный раствор во время ферментации фильтруют через фильтрационную систему в поперечном потоке и извлеченное количество фильтрата в ферментере может быть замещено.

Acremonium chrysogenum (Cephalosporium acremonium), а также мутанты, пока они продуцируют СРС-производные, пригодные согласно изобретению для использования в способе.

Питательный раствор содержит источники углерода, такие как сахароза, кукурузный крахмал, декстроза или меласса, и источники азота, такие как соевая мука, арахисовая мука, солодовый экстракт или ацетат аммония.

Питательная среда также содержит неорганические соли, такие как гидрофосфат натрия, хлорид натрия, хлорид кальция, сульфат кальция, карбонат кальция, сульфат магния или гидрофосфат калия. Далее к питательной среде можно также добавлять жир, такой как сложный метиловый эфир олеиновый кислоты или соевое масло. Наряду с этим также можно добавлять микроэлементы, такие как соли железа, марганца, меди, цинка, кобальта или других металлов.

Культивирование Acremonium chrysogenum (Cephalosporium acremonium), предпочтительно DSM 6473, осуществляют при 20 30, предпочтительно при 25^oC, и при значениях pH 5 8, предпочтительно при pH 7. Культивирование осуществляют сначала аэробно в колбах для встряхивания, а затем в ферментере при перемешивании и аэрации с помощью воздуха или чистого кислорода. Культивирование микроорганизмов в ферментерах осуществляют в течение 120 - 240, предпочтительно 130 170 ч.

В качестве фильтрационной системы в поперечном потоке можно применять пластинчатые, трубчатые, в виде капиллярных трубок, спиральные или в виде полых волокон мембранные модули из полимеров, углерода или керамики с границами раздела от области ультрафильтрации до области стерильной фильтрации. Предпочтительно используют фильтрацтонные модули с размером пор 0,2 мкм или 4 нм. В качестве материалов мембран можно использовать полисульфоны, полиамиды, ацетат целлюлозы, окись алюминия или окись циркония.

Фильтрацию можно осуществлять непрерывно или периодически. Она начинается примерно спустя 2 3 дн после инокулирования ферментера и может продолжаться вплоть до окончания ферментации. Скорость перетекания раствора ферментера через поверхность фильтрации составляет 0,5 20, предпочтительно 1 10 м/с.

Фильтрат, который во время фильтрации выводится из ферментера, можно заменять соответствующим количеством жидкости или после отделения ценного продукта (например, путем абсорбции, фильтрат можно возвращать в ферментер), при этом можно вводить воду, обогащенную соответствующими солями или другими составными частями питательной среды.

Объем жидкость, не проникающий через мембрану, снова возвращается в ферментер.

Ферментер и фильтрационная система в поперечном потоке связаны соответствующими трубами или рукавами и стерилизуются перед ферментацией. Для ферментера емкостью 100 л необходима поверхность фильтрации размером примерно 0,2 м². Можно применять также большие или меньшие поверхности фильтрации.

Пример 1. Ферментация Acremonium chrysogenum DSM 6473.

Ферментацию осуществляют с следующем питательном растворе:
Среда для предварительной, г/л:
Зерновая замочка (Cornsteep) 11,75
Ацетат аммония 4,5
Сахароза 20,0
CaSO₄•2H₂O 0,5
MgSO₄•7H₂O 0,5
pH 7,0 [установлено с помощью 15 мас. NaOH]
Ферментационная среда, г/л:
Обезжиренная арахисовая мука 100,0
Ацетат аммония 6,0
Моногидрат глюкозы 5,0
Метилолеат 5,0
D, L-метионин 3,0
CaSO₄•2H₂O 5,0
MgSO₄•7H₂O 5,0
CaCO₃ 5,0
Антивспениватель 5,0
Исходный раствор:
Моногидрат глюкозы 500,0
D, L-метионин 24,75
Культуры, выросшие на косом агаре, применяют для инокулирования 100 мл среды для предварительной культуры (колбы для встряхивания емкостью 500 мл с 4 зубцами). Колбы инкубируют в течение 48 ч при 150 об/мин и при 25 28^oC. Эти культуры применяют для инокулирования другой предварительной культуры (1000 мл среды; колбы емкостью 5000 мл; 25-28^oC; 120 об/мин; 58 60 ч). Второй предварительной культурой инокулируют 60 л среды для ферментации в ферментере с перемешиванием. Ферментацию осуществляют при 25^oC. Пропускание газа регулируют таким образом, что pO₂ в ферментационном питательном растворе составляет свыше 20%
После ферментации в течение 74 ч. начинается фильтрация с помощью керамического модуля в поперечном потоке [фирма "Membraflow", a-Al₂O₃] с поверхностью фильтра 0,2 м² и размером пор 0,2 мкм. При этом соблюдаются следующие параметры процесса:
Скорость перетекания 2 м/с
Скорость перекачивания 1500 л в ч
Производительность фильтрации 2 л в ч
Время фильтрации 68 ч
В табл. 1 показаны результаты исследований после 142 ч. ферментации без фильтрации (А) и с фильтрацией в поперечном потоке (В).

Пример 2. Ферментацию осуществляют как в примере 1. В табл. 2 приводятся результаты после 167 ч ферментации с фильтрацией в поперечном потоке (В) по сравнению с параллельной ферментацией без фильтрации (А), которую прекращают спустя 142 ч.

Использование: микробиология, в частности получение антибиотиков. Сущность изобретения: ферментационное получение цефалоспорина С предусматривает ферментацию продуцента Acremonium chrysogenum в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли в аэробных условиях, с последующей фильтрацией ферментационного раствора через фильтрационную систему в поперечном потоке, в качестве которой применяют полимерный или керамический фильтр с размером пор 4 - 200 нм со скоростью протекания через поверхность фильтра 1 - 10 м/с, при этом фильтрацию раствора проводят во время ферментации с замещением количества фильтрата в ферментере водой или питательным раствором. 3 з. п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ ферментативного получения цефалоспорина С, предусматривающий ферментацию продуцента Acremonium chrysogenum в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли в аэробных условиях с последующей фильтрацией ферментационного раствора через фильтрационную систему в поперечном потоке и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что фильтрацию ферментационного раствора проводят во время ферментации с замещением количества фильтрата в ферментере. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве фильтрационной системы в поперечном потоке применяют полимерный или керамический фильтр с размером пор 4 200 нм. 3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что скорость перетекания через поверхность фильтра составляет 1 10 м/с. 4. Способ по пп. 1 3, отличающийся тем, что фильтрат в ферментере замещают водой или питательным раствором.