СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2001 года по МПК C12P7/56 C12P7/56 C12R1/225 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается микробиологического метода получения молочной кислоты.

Молочнокислое брожение - один из первых ставших известными человечеству процессов и получение молочной кислоты микробиологическим методом имеет давнюю историю.

Гомоферментативное молочнокислое брожение, при котором синтезируется исключительно молочная кислота, может вызываться микроорганизмами различных таксономических групп, но главным образом бактериями и микроскопическими грибами, в частности, некоторыми видами родов Rizopus и Mucor.

Однако, практически все современные технологии получения молочной кислоты основаны на культивировании тех или иных термофильных штаммов лактобацилл, преимущественно Lactobacillus delbruckii при температуре 48-50^oC с последующим выделением биосинтезируемой молочной кислоты из ферментационной среды. Культивирование продуцента осуществляют отъемно-доливным методом как правило в течение 10-12 суток, в процессе которого часть культуральной жидкости отбирают и направляют на дальнейшую переработку, а оставшуюся часть используют как посевной материал, в который вносят свежую порцию питательной среды, и цикл культивирования повторяют.

В результате, накопление молочной кислоты в культуральной жидкости составляет обычно 110-130 г/л, а степень конверсии сахаров достигает 90-98%. Удельный выход молочной кислоты лежит в пределах 0,2-0,4 г/л/час (1).

Традиционность использования такой технологической схемы получения молочной кислоты обусловлена теми благоприятными обстоятельствами, что в условиях повышенной температуры не развивается посторонняя микрофлора и осуществление процесса не требует специального соблюдения условий стерильности.

Существенным недостатком описанного способа получения молочной кислоты является длительность процесса биосинтеза, а с этим связаны, в первую очередь, довольно значительные затраты энергоресурсов, необходимые для поддержания соответствующего температурного режима, и малая оборачиваемость производственного оборудования (коэффициент использования оборудования).

Варианты осуществления данного способа различаются использованными культурами-продуцентами, условиями осуществления ферментации (2), составом применяемых питательных сред (1-2), методами выделения конечного продукта (2).

В частности, в качестве продуцентов молочной кислоты предложены гетероферментативный штамм Lact. pentoaceticum В(в)-23, образующий смесь уксусной и молочной кислот (3), гомоферментативная культура Lact. bulgaricus DSM 2129 (4), Azomonas agilis-24, используемый для стимулирования роста рыб (5).

Наиболее близким по эффективности к предложенному можно признать способ получения молочной кислоты, предусматривающий выращивание культуры Lactobacillus bulgaricus DSM 2129 при температуре 30-50^oC, особенно при 40-45^oC. Продуктивность способа составляет до 115 г/л молочной кислоты за 48 часов (4).

Цель изобретения - повышение удельного выхода молочной кислоты на стадии биосинтеза и дополнительно снижение энергозатрат на осуществление процесса.

Поставленная цель была достигнута в результате использования в качестве продуцента молочной кислоты кокковых форм молочнокислых бактерий, способных расти при повышенной температуре.

То, что среди многочисленной группы кокков существуют культуры, биосинтезирующие молочную кислоту, относимые к молочнокислым бактериям, общеизвестно, равно как и то, что среди кокковых форм молочнокислых бактерий имеются термофильные и термотолерантные культуры. Однако, сведений об использовании кокковых форм термотолерантных и термофильных молочнокислых бактерий для производства молочной кислоты, по данным заявителя, не имеется.

Возможно, это связано с тем, что классический метод получения молочной кислоты с использованием термофильных лактобацилл по технико-экономическим показателям устраивает производителей и дальнейшие поиски в этом направлении просто не ведутся.

Отсутствие попыток использования кокковых форм термофильных молочнокислых бактерий для производства молочной кислоты можно объяснить лишь консерватизмом исследователей и сравнительно малой распространенностью таких микроорганизмов.

Неиспользование кокковых форм молочнокислых бактерий для промышленного производства молочной кислоты может быть связано с тем, что бытует мнение, что "палочковые формы дают больший выход молочной кислоты" (1, с. 199).

Неиспользование термотолерантных молочнокислых бактерий для промышленного производства молочной кислоты, по-видимому, связано с тем, что термофильные молочнокислые бактерии можно выращивать при 48-50^oС, а термотолерантные молочнокислые бактерии имеют температурный оптимум роста только 40-45^oC и это вызывает опасения значительного загрязнения термотолерантной культуры посторонней микрофлорой. В специальной литературе, например, прямо указывается, что при снижении температуры культивирования ниже 45^oC "неминуемо (выделено нами, авт.) разовьется посторонняя микрофлора" (1, с. 208).

Однако, высказываемые мнения, справедливые для палочковидных форм молочнокислых бактерий, не оправдываются, как установил заявитель, для кокковых форм молочнокислых бактерий.

Из общих основ микробиологии известно, что кокковые формы бактерий растут намного быстрее палочковидных форм. Однако, этот феномен в отношении молочнокислых бактерий количественно не исследовался и в технологии использования этих микроорганизмов не учитывался.

Заявитель впервые сравнил динамику роста и удельный выход молочной кислоты при использовании в качестве продуцента молочной кислоты палочковидных и кокковых форм молочнокислых бактерий и соответствующие результаты представлены в табл. 1.

Полученные результаты показывают, что кокковые формы молочнокислых бактерий обладают более высокой скоростью роста, чем палочковидные формы. Так, максимально возможное количество молочной кислоты - 150-170 г/л накапливается у кокковых форм в течение первых суток. Термотолерантные палочки за двое суток накапливают 115 г/л молочной кислоты, а термофильные палочки всего 30 г/л, т.е. в 5-6 раз меньше. Удельный выход молочной кислоты - продуктивность у кокковых форм выше от 1,5 до 4,0 раз. Незначительно, но выше и коэффициент трансформации сахаров в молочную кислоту у кокковых форм.

Отсюда можно заключить, что кокковые формы молочнокислых бактерий экономически более выгодны как продуценты молочной кислоты, чем палочковидные формы.

При этом необходимо особо подчеркнуть, что при культивировании кокковых форм термотолерантных молочнокислых бактерий при 45^oC (как и при культивировании палочковидных форм термофильных молочнокислых бактерий при 50^oC) загрязнения культуры посторонней микрофлорой не происходит! Это обстоятельство обусловлено тем, что скорость роста кокковых форм молочнокислых бактерий по сравнению с палочковидными формами оказалась достаточно высокой для того, чтобы препятствовать развитию посторонней микрофлоры при снижении температуры культивирования с 50 до 45^oC, а именно выше в 3-4 раза. Это подтверждает особую экономическую целесообразность использования в качестве продуцента молочной кислоты именно кокковых форм термотолерантных и термофильных молочнокислых бактерий. Использование кокковых форм термофильных молочнокислых бактерий имеет менее выраженные преимущества перед использованием термотолерантных форм молочнокислых бактерий, т.к. поддержание температуры культивирования при 50^oC более энергоемкий процесс, да и скорость образования молочной кислоты у них ниже.

Таким образом, заявителю удалось преодолеть существовавшее заблуждение относительно того, что культивирование молочнокислых бактерий без особого соблюдения условий стерильности возможно только при использовании термофильных лактобацилл при их выращивании при повышенной температуре.

Существо предложенного способа получения молочной кислоты состоит в следующем.

В качестве продуцента молочной кислоты используют кокковые формы молочнокислых бактерий, способных расти при повышенной температуре, особенно термотолерантных бактерий.

Могут быть использованы культуры видов Str. falcium, L.acidophillus v. coccoideus, Str. therniophullus.

Наиболее благоприятна для использования культура Streptococcus faecium, образующая исключительно молочную кислоту.

Результаты, представленные в табл. 2, показывают, что для осуществления данного изобретения пригоден широкий круг кокковых форм молочнокислых бактерий.

Культивирование кокковых форм термотолерантных и термофильных молочнокислых бактерий осуществляют на традиционно используемых для выращивания молочнокислых бактерий питательных средах и каких-либо особенностей в данном случае не имеется.

В качестве источника углерода могут быть использованы, например, лактоза, глюкоза, сахароза, а в качестве источника азота - автолизаты дрожжей (БВК, пивные, пекарские). Среда может быть дополнена стимулирующими рост бактерий и биосинтез молочной кислоты добавками, такими как кукурузный экстракт, солодовые ростки.

Выращивание осуществляют при 40-45^oC или 48-50^oC в случае термотолерантных или термофильных организмов, соответственно, в традиционных для данных микроорганизмов условиях.

Биосинтезируемая молочная кислота должна в процессе культивирования нейтрализоваться с помощью CaO или Ca(ОН)₂.

Длительность ферментации составляет обычно 12-20 часов и накопление в ферментационной среде молочной кислоты достигается в среднем 150-170 г/л.

Выделение молочной кислоты из ферментационной среды осуществляют известными приемами, например, перевод лактата Ca в молочную кислоту с H₂SO₄.

Более подробно сущность предложенного способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Ферментер емкостью 1,5 л был заполнен 1 л питательной среды следующего начального состава: ферментолизат кормовых дрожжей (биотрин) - 3% (по АСВ) сахароза - 3,0%. Питательная среда была засеяна кокковой формой термотолерантных молочнокислых бактерий Streptococcus faeсium 3185 Т в посевной дозе - 5 об. %. Культивирование проводили при температуре 45^oC, при постоянном перемешивании питательной среды. Поддержание pH на уровне 6,6-6,8 осуществляли путем нейтрализации образующейся молочной кислоты внесением Ca(ОН)₂. Проводили контроль потребления сахара. При снижении концентрации сахара до 0,4% в среду вносили 2,5% сахара и солодовые ростки в количестве 5 г на 100 г сахара. Биосинтез молочной кислоты заканчивался через 16 часов, при этом было синтезировано 170 г/л молочной кислоты, 90% культуральной жидкости отбирали для выделения молочной кислоты. 10% культуральной жидкости оставляли в ферментере в качестве посевного материала. В ферментер заливали питательную среду, указанного выше состава, до 1 л и цикл биосинтеза повторяли. Всего возможным оказалось проведение 16 циклов без инфицирования. В отобранную культуральную жидкость добавляли эквимолярное лактату Ca количество серной кислоты (H₂SO₄). При этом лактат Ca переходил в молочную кислоту, гипс CaSO₄ выпадал в осадок. Осветление молочной кислоты от гипса осуществляли фильтрованием.

Пример 2.

Ферментер емкостью 1,5 л был заполнен 1 л питательной среды следующего начального состава: автолизат пивных дрожжей - 4% (по ACB), глюкоза - 5%.

Питательная среда была засеяна кокковой формой термофильных молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophillus var. coccoideus в посевной дозе 3 об. %. Культивирование проводили при 48^oC при постоянном перемешивании. Поддержание pH на уровне 6,4-6,6 осуществляли путем нейтрализации молочной кислоты оксидом Ca - CaO.

Проводили контроль потребления глюкозы. При снижении концентрации глюкозы до 0,5% в среду вносили 4% глюкозы и солодовые ростки в количестве 5 г на 100 г глюкозы.

Биосинтез молочной кислоты заканчивался через 12 часов, при этом в среде обнаружено 175 г/л молочной кислоты.

95% культуральной жидкости отбирали и проводили выделение молочной кислоты так, как это описано в Примере 1.

К 5% оставшейся в качестве посевного материала культуральной жидкости добавляли до 1 л питательную среду начального состава и повторяли цикл биосинтеза. Без инфицирования процесса удалось провести 24 цикла.

Пример 3.

В ферментер емкостью 1,5 л вносили 1 л питательной среды следующего начального состава: автолизат пекарских дрожжей - 4%, лактоза - 4%. Питательную среду засевали термофильной культурой кокков Streptococcus thermophillus MT в дозе 10 об.%. Культивирование проводили при 50^oC при постоянном перемешивании. Нейтрализацию молочной кислоты осуществляли добавлением Ca(ОН)₂, поддерживая pH среды на уровне 6,8-7,0.

Контролировали потребление лактозы, при снижении ее концентрации до 0,3% в культуральную жидкость вносили 3% лактозы и солодовые ростки из расчета 5 г на 100 г лактозы.

Процесс биосинтеза закончился через 24 часа, конечное содержание молочной кислоты составило 145 г/л.

90% культуральной жидкости подвергали обработке, как описано в Примере 1 для выделения молочной кислоты.

К оставшимся 10% культуральной жидкости добавляли питательную среду до 1 л и повторяли цикл биосинтеза.

Всего было проведено 26 циклов без появления посторонней микрофлоры.

Таким образом, по сравнению с известными традиционными способами получения молочной кислоты, предложенный способ предусматривает использование в качестве продуцента кокковых форм молочнокислых бактерий, способных к росту при повышенной температуре, преимущественно термотолерантных молочнокислых бактерий, выращиваемых при оптимальной для их развития 40-45^oC.

Использование предложенного способа позволяет при использовании кокковых форм термофильных молочнокислых бактерий повысить удельный выход молочной кислоты, а при использовании термотолерантных молочнокислых бактерий - дополнительно существенно снизить энергозатраты.

По сведениям заявителя отличительный прием предложенного способа - использование в качестве продуцента молочной кислоты кокковых форм молочнокислых бактерий, способных расти при повышенной температуре - для решения поставленной заявителем задачи - увеличение удельного выхода молочной кислоты и снижения энергозатрат - не использовался.

Заявитель полагает, что ему удалось преодолеть существовавшее предубеждение против использования кокковых форм молочнокислых бактерий для производства молочной кислоты и получить неочевидный результат - осуществить процесс при более низкой, чем ранее, температуре без инфицирования ферментационной среды посторонней микрофлорой. Это дает заявителю основание считать, что предложенный способ соответствует требованиям, предъявляемым к изобретению.

Источники информации, принятые во внимание
1. Смирнов В.А. Пищевые кислоты. М., "Легкая и пищевая промышленность", 1983 г., ст. 196-222.

2. Квасников Е. И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и их роль в народном хозяйстве. М., Наука, 1985 г.

3. Авт.свид. СССР 732387, М. кл. С 12 P 7/56, 1980 г.

4. Патент СССР 1139375, М. кл. С 12 P 7/56, 1985 г.

5. Авт.свид. СССР 1161554, М. кл. С 12 P 7/56, 1985 г.

Изобретение относится к области биотехнологии. В способе в качестве продуцента используют кокковые формы термотолерантных или термофильных молочнокислых бактерий, в частности Streptococcus faecium, Streptococcus thermophillus и Lactobacillus acidophilus var. coccoideus. Способ обеспечивает повышение удельного выхода молочной кислоты. 3 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения молочной кислоты путем выращивания продуцента - молочнокислых бактерий, способных к росту при повышенной температуре - в оптимальных для его развития условиях с последующим выделением целевого продукта из ферментационной среды, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют кокковую форму молочнокислых бактерий. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют кокковые формы термотолерантных термофильных молочнокислых бактерий. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют термотолерантную культуру Streptococcus faecium, а выращивание проводят при 40-45^oС. 4. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют термофильные культуры Streptococcus thermophilus или Lactobacillus acidophilus var. coccoideus, а выращивание проводят при 48-50^oС.