СПОСОБ ИНДИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/04 G01N33/569 C12Q1/04 C12R1/07 G01N33/543 G01N33/554 

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для экспрессной индикации бактериальных средств при возникновении чрезвычайных ситуаций.

Известен способ постановки реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) при индикации бактериальных средств, который включает титрование исследуемого материала в разводящей жидкости, внесение эритроцитарного диагностикума и наблюдение за формированием эритроцитами диагностикума на днищах емкостей типичной картины окончания реакции (Инструкция по применению серологических методов диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы. Саратов, 1974, с. 38 -39).

Также известен способ постановки реакции непрямой суспензионной аггломерации (РНСА) при обнаружении бактериальных антигенов, который проводят по типу РПГА и который включает титрование исследуемого материала в разводящей жидкости, последующее внесение полимерных (латексных) частиц диагностикума и наблюдение за формированием типичной картины окончания реакции (современные аспекты природной очаговости, эпидимиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней. Тезисы докладов научной конференции. Омск, октябрь, 1993, Ставрополь, 1993, с. 214-215).

Реакция пассивной гемагглютинации и реакция непрямой суспензионной агломерации и их варианты (РТПГА, РАО и т.д.) фактически представляют собой тип реакции агломерации с иммуносуспензионными диагностикумами, приготовленными на основе физических носителей эритроцитов или латексных (полиакролеиновых) частиц. Приведенное обобщение выявляет основные особенности вышеуказанных реакций по сути.

Недостатками описанных способов индикации является длительность реакций (1,5 4 ч) и недостаточная точность учета результатов, что обусловлено визуальным определением наличия феноменов образования "пуговок" или "зонтиков".

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является выбранный в качестве прототипа способ диагностики возбудителя чумы по обнаружению капсульного антигена в реакции агглютинации латексного антительного диагностикума [1]
Этот способ включает постановку двух отдельных серологических реакций, проводимых объемным и капельным методами, и осуществляется следующим образом.

Объемным методом серодиагностику капсульного антигена проводили путем постановки реакции агглютинации латекса по типу РНСА в лунках планшета для иммунологических реакций с микробными взвесями возбудителя чумы лил с растворами антигена с использованием диагностикума чумного иммуноглобулинового полиакролеинового. Учет результатов реакции проводили через 1,5 2,0 ч по формированию типичной картины окончания реакции (наличию феноменов -"зонтик"-"пуговка").

Капельным методом экспресс-диагностику проводили путем постановки реакции агглютинации на стекле, осуществляя учет результатов реакции через 4 15 мин по наличию видимых хорошо сформированных агломератов с полным просветлением жидкости.

У прототипа и предлагаемого способа имеются следующие сходные существенные признаки.

Проведение реакции агломерации путем внесения в раститрованный исследуемый материал диагностикума с последующим учетом результатов реакции.

Недостатком прототипа является неудовлетворительная точность экспресс-диагностики. Оценку результатов осуществляют визуально, что до некоторой степени носит субъективный характер. Учет результатов реакции, выполняемой капельным методом на стекле, возможен только в течение 4 15 мин с момента ее постановки, поскольку через 30 мин появляются спонтанные агломераты в отрицательных контролях. Кроме того, постановка серологической реакции капельным методом связана с необходимостью отдельного проведения раститровки исследуемого материала с возможным растеканием капель на поверхности стекла и смешиванием с рядом расположенными каплями, что приводит к нестандартным условиям образования и учета комплексов агломератов.

Более точный учет результатов реакции агломерации с иммуносуспензионным диагностикумом возможен через 3 4 ч, что не обеспечивает экспрессности способа. Кроме того, оценка результатов по наличию феноменов "зонтиков" и "пуговок" осуществляется визуально и до некоторой степени носит субъективный характер.

Целью изобретения является обеспечение экспрессности диагностики бактериальных антигенов за счет ускорения учета реакции агломерации и повышения точности ее результатов.

Поставленная цель достигается тем, что исследуемый материал смешивают с иммуносуспензионным диагностикумом, например, на основе латексных частиц, эритроцитов в разводящей жидкости и через ее слой высотой 1,0 2,0 мм пропускают лазерный луч денситометра, результаты агломерации учитывают через 1 2 мин по увеличению пиков оптической плотности относительно базовой линии в 2 4 раза. При оптимально подобранных параметрах высоты слоя реакционной смеси процессы взаимодействия специфических антител, фиксированных на эритроцитарных или полиакролеиновых диагностикумах с гомологичными антителами, начинающиеся сразу же после смешивания ингредиентов, могут быть зафиксированы в течение первых 30 40 с с помощью денситометра. При этом уменьшение высоты слоя реакционной смеси менее 1 мм или более 2 мм не дают четко выраженных отличий величин пиков оптической плотности в опытных и контрольных лунках. По величине пиков оптической плотности в контрольных лунках отмечают уровень базовой линии для сравнения и учета результатов реакций агломерации. Зависимость изменений величины пиков оптической плотности в опытных и контрольных лунках от высоты слоя реакционной смеси представлена на чертеже, где по оси ординат отмечены измеренные в миллиметрах значения величины пиков оптической плотности, а по оси абсцисс увеличение концентрации исследуемого материала в направлении от нулевой точки. На графике I представлена вышеуказанная зависимость при оптимальной высоте слоя реакционной смеси 1,5 мм; на графиках II и III та же зависимость при значениях высоты слоя реакционной смеси меньше и больше вышеуказанных параметров, а именно 0,7 и 3,0 мм.

Таким образом, экспериментально определены оптимальные параметры высоты слоя реакционной смеси 1,0 2,0 мм, которые позволяют получать точные результаты с помощью приборов при учете реакций агломерации с иммуносуспензионными диагностикумами на основе эритроцитов и полиакролеиновых частиц в течение 1 2 мин. Установленное время учета очевидно является предельно возможным при практическом обнаружении множественных взаимодействий специфических антител и гомологичных антигенов.

Способ поясняется чертежом.

Пример 1. Исследуемый материал смыв с поверхности (в дальнейшем смыв), зараженный клетками чумного вакцинного штамма Y.pestis EV в концентрации 0,2•10⁷ м. к./мл, обеззараживали формалином. Смыв в объеме 50 мкл вносили в начальную лунку плоскодонной полистироловой пластины, заполненной по 50 мкл разводящей жидкости в каждой лунке. Смыв титровали в семи лунках с удалением 50 мкл из последней. В лунки с раститрованным смывом и в контрольную вносили по 25 мкл 0,15% взвесь чумного полиакролеиного иммуноглобулинового диагностикума. Из каждой лунки удаляли 47 мкл реакционной смеси. При этом высота слоя смеси составляла 1,0 мм. Учет результатов реакции осуществляли лазерным денситометром LKB 2202 (Швеция) с записью изменений оптической плотности на ленте самописца LKB 2210 (Швеция) в виде пиков. При высоте слоя 1 мм величина оптической плотности пика реакционной взвеси в лунке со смывом, где концентрация 32 тыс. м.к./мл в два раза превышала уровень базовой линии, отмечаемой по высоте пика контрольной лунки. Величины пиков оптической плотности в лунках с концентрацией 62,5 тыс. м.к./мл и выше в четыре раза превышали уровень базовой линии. Результаты были получены через 1 мин.

Контроль полученных результатов осуществляли с помощью РНСА, поставленной по объемной методике и учитываемой визуально через 3 ч по наличию феноменов "зонтиков" и "пуговок". Титр реакции составил 125 тыс. м.к./мл в лунке, где "зонтик" занимал не менее 2/3 сферической поверхности днища.

Таким образом, учет результатов реакции агломерации с иммуноглобулиновым латексным диагностикумом с помощью денситометра позволил повысить точность метода в 4 раза и сократить сроки получения результатов до 1 мин.

Пример 2. Отличается от вышеописанного примера 1 тем, что высота слоя реакционной смеси составляла 1,5 мм. Для этого в каждой лунке оставляли по 57 мкл смеси.

При высоте слоя 1,5 мм величина пика оптической плотности смеси в лунке, где концентрация была 31 тыс. м.к./мл, в три раза превышала уровень базовой линии, отсчитываемой от высоты пика контрольной лунки. Величина пиков оптической плотности в лунках концентрацией 62,5 тыс. м.к./мл и выше более чем в четыре раза превышала уровень базовой линии. Время учета составляло 1 мин, точность метода увеличилось в 4 раза.

Пример 3. Отличается от вышеописанного примера 1 тем, что высота слоя реакционной смеси составляла 2,0 мм, что соответствовало наличию 85 мкл смеси в каждой лунке, а в качестве диагностикума использовали иммуноглобулиновые эритроциты, 2,5% взвесь которых в объеме 50 мкл вносили в каждую лунку с раститрованным смывом. При высоте слоя 2,0 мм величина пика оптической плотности реакционной смеси в лунке, где концентрация клеток составляла 31 тыс. м.к./мл и в два раза превышала уровень базовой линии, отмечаемой по высоте пика контрольной лунки. Величина пиков оптической плотности в лунках с концентрацией 62,5 тыс. м.к./мл и выше в четыре раза превышала уровень базовой линии. Результаты были получены через 2 мин.

Контроль полученных в данном опыте результатов осуществляли с помощью РПГА, поставленной по обычной методике с эритроцитарным диагностикумом и учитываемой визуально через 4 ч по наличию феноменов "зонтиков" и "пуговок". Титр реакции составлял 125 тыс. м.к./мл в лунке, где "зонтик" занимал не менее 2/3 сферической поверхности днища.

Таким образом, учет результатов реакции агломерации с иммуноглобулиновым эритроцитарным диагностикумом с помощью денситометра LKB 2202 (Швеция) и самописца LKB 2210 (Швеция) позволил повысить точность метода в 4 раза и сократить сроки получения результатов до 1 мин.

Таким образом, предлагаемый в качестве изобретения способ индикации бактериальных антигенов реально осуществим, полученные с его помощью данные полностью коррелируют с таковыми, полученными с использованием известных методов, однако отличаются скоростью получения результатов до 1 мин и повышением чувствительности в 4 раза, что обеспечивает возможность организации экстренной индикации бактериальных антигенов в чрезвычайных ситуациях.

Использование: иммунология, экспрессная индикация бактериальных средств при возникновении чрезвычайных ситуаций. Цель изобретения -обеспечение экспрессной диагностики, агломерации и повышения точности ее результатов. Сущность изобретения: исследуемый материал смешивают с иммуносуспензионным диагностикумом, например, на основе латексных частиц или эритроцитов в разводящей жидкости. Через ее слой высотой 1,0 - 2,0 мм пропускают лазерный луч денситометра. Результаты агломерации учитывают через 1-2 мин по увеличению пиков оптической плотности относительно базовой линии в 2-4 раза. Способ может быть использован для экспрессной диагностики, т.к. позволяет ускорить проведение учета реакции и повысить точность диагностики. 1 ил.

Способ индикации бактериальных антигенов в реакции агломерации, включающий смешивание исследуемого материала с иммуносуспензионным диагностикумом в разводящей жидкости с последующим учетом результатов агломерации, отличающийся тем, что через слой смеси высотой 1,0 2,0 мм пропускают лазерный луч денситометра, а результаты агломерации учитывают через 1 2 мин по увеличению пиков оптической плотности относительно базовой линии в 2 4 раза.