Способ определения деструкции эндоплазматического ретикулума клеток печени Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 A61B10/00 

4ii (О

00 Изобретение относится к биохимии и экспериментальной медицине и может найти применение как скрининг-тест для выявления повреждений мембраны эндоплазматического ретикулума печени при моделировании заболеваний печени и оценке эффективности дейстВИ8 гепатотропных лекарственных средств. Известен способ оценки состояния плазматических мембран печени по выходу в кровь ферментов цитозоля клеток печени (альдолазы, аминотрансферазы, лактатдегидрогеназы и др.), на ступающего при разрушении плазматических мембран lj . Однако указанный способ не характеризует состояние внутриклеточных мембран, в частности мембран эндоплазматического ретикулума,. в которьгх локализованы ферментные системы ответственные за детоксицирующую функцию печени, И наконец, ферменты появляющиеся в крови при разрушении плазматических мембран печени, не обладают абсолютной специфичностью для печеночной ткани. Активность этих ферментов в крови может возрастать и при повреждении других органов и тканей, например при поражении миокарда, поперечно-полосатой мускулатуры, почек и др. Цель изобретения - создание стсрининг-теста, специфичного для повреждения мембран эндоплазматического ретикулума печени, позволяющего выявлять повреждения мембран на ранних стадиях заболевания. Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения де струкции эндоплазматического ретикулума клеток печени путем исследов ния активности ферментов, в гомогенате клеток печени определяют скорость инактивации цитохрома Р-450 и при увеличении ее уровня по сравнен с нормой определяют деструкцию эндо плазматического ретикулума. Способ осуществляют следующим об разом. Кусочки ткани печени в 0,5-1,0 г гомогенизируют в 6 мл 100 мМ трис -Н буфера, рН 7,6 полученный гомогенат помещают в кюветы спектрофотометра, через опытную кюцету в течение 1 ми пропускают окись углерода, в обе кю веты добавляют по несколько кристал ликов диттюннта натрия и при 37 С в Tr-ifejf-M 10 NfHii с интервалами по 5 мин записывают спектры поглощения кoмплeкcia восстановленной формы цитохрома Р-450 с окисью углерода в интервале длины волн 400-500 нм. Скорость инактивации регистрируют спектральными методами и оценивают изменение разницы поглощения при 420 и 450 нм (. им) . Полученные результаты сравнивают со скоростью инактивации в неповрежденной печени и при скорости инактивации выше, чем в контроле, устанавливают повреждение мембран эндоплазматического ретикулума . П р и м е р 1 . Повреждения мембран печени крыс вызывали введением животным внутрибрюшинно фенобарбитала (8 мг/ЮО г веса) в течение 3 дн. Контрольным животным внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. Каждая из групп состояла из десяти животцых. Через 24 ч после прекращения введения фенобарбитала животных забивали декапитацией . В гомогенатах из печени на спектрофотометре Хитачи-356 регистрировали скорость инактивации цитохромаР-450 по A iO-45Q™Через 30 мин после восстановления цитохрома Р-450 дитионитом натрия в гомогенатах печени контрольных крыс в спектре поглощения отмечается максимум при 420 нм, характеризуюш;ий переход цитохрома Р-450 в неактивную форму - цитохром Р-420. При сравнении скорости инактивации цитохрома Р-450 в гомогенатах из печени контрольных и получавших фенобарбитал жи- вотных выявляют деструкцию мембран эндоплазматического ретикулума фенобарбиталом, о чем свидетельствует резко выраженное возрастание скорости инактивации цитохрома Р-450. Пример 2. Повреждения мембран печени крыс вызывали введением жи вотным внутрибрюгаинно гелиотрина (30 мг/100 г веса) однократно. Контрольным крысам внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. Через 24 ч животных забивали декапитдцией. Скорость инактивации цитохрома Р-450 в гомогенатах печени регистрировали аналогично примеру 1. Повреждение мембран эндоплазматического ретикулума гелиотрином сопровождается резким возрастанием скорости инактивации цитохрома Р-450. Таким образом, регистрация скорости инактивации цитохрома Р-450

311428024

в гомогенатах печени может быть ис- перименте - при моделировании заболепользована как скрининг-тест для вы- ваний печени и исследований эффективявления повреждений мембран эндоплаз- кости действия гепатотропных лекарст

матического ретикулума печени в экс- венных средств

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕСТРУКЦИИ ЭНДОШ1АЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА КЛЕТОК ПЕЧЕНИ путем исследования активности ферментов, о т ли ч а rani и и с я тем, что, с цедаю новышения специфичности способа, в го- могенате клеток печени определяют скорость инактивации цИтохррма Р-450 и при увеличении её уровня по сравнению с нормой определяют деструкцию эндоштазматического ретикулума.