Способ определения содержания лизоцима Советский патент 1985 года по МПК C12Q1/00 

Оптииеслоя п/1относте

1.О 0.9 0,8 . 0,7 0,6 0.5 ОА Q-f 0,2 0.1

2500

5000

125О

VO

4 СА

CoSfp/Kome .,

ч1

fft/fM

00

ЗГ2

J56

79

J9 Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для определения содержания лизоцима в биологических жидкостях, тканях и молоке, в клинической и экспериментальной медицине в медицинской и молочной промьтленности. Наиболее близким к изобретени по технической сущности и достигаемому результату является способ определения содержания лизоцима, который заключается в том, что субстрат клеточных стенок Micrococcus lysodeikticus добавляют к агару Difсо. Сыворотку или другую биоло гическую жидкость вносят в лунки агара. Чашки инкубируют в термостат при 37°С в течение 20 ч. Содержание лизоцима определяют путем сравнения диаметров зон лизиса субстрата исследуемыми образцами и стандартными растворами лизоцима. Концентрацию лизоцима вычисляют по стандартной полулогарифмической кривой. Однако известный способ является длительным и трудоемким (требует пр готовления агаровой среды с субстра том) , мало чувствителен, так как зависит от диффузии лизоцима в агар и частичного его связывания агаровы гелем. Кроме того, способ является недостаточно точным, так как полученные результаты оцениваются визуально путем измерения зон задержки роста тест микроба. Цель изобретения - ускорение способа, повышение его чувствительности и точности. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения содержания лизоцима путем инкуб ции биологической жидкости с клеточ ньми стенками Micrococcus lysodeikticus, инкубацию проводят 10-15 мин при комнатной температуре, добавляю раствор 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода, затем прибавляют раствор пероксидазы и спектрофотометрируют. Способ осуществляется следующим образок. Определение лизоцима в исследуем биологической жидкости начинают с построения стандартной кривой. Для этого лизоцим титруют в 0,5 мл физи логического раствора начиная с 5000 до 38 нг/мл. Из полученных разведе78JНИИ лизоцима отбирают по 0,1 мл и переносят в два параллельных ряда большого пластикового планшета для микроагглютинации. Взвесь стенок Micrococcus lysodeikticus с концентрацией 1 мг/мл готовят перед исследованием и после тщательного растирания в физиологическом растворе добавляют по 0,05 мл к разведениям лизоцима. Инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 10-15 мин, после чего к реакционной смеси добавляют по 0,5 мл субстрата на пероксидазу (0,08%-ный раствор 5-аминосалициловой кислоты с 0,05%ным раствором перекиси водорода (,Ci2} в соотношении 9:1). Через 2-3 мин инкубации к полученной смеси добавляют 0,05 мл 0,04%-ного раствора пероксидазы. В контроле светложелтый раствор субстрата 5-АСх xHjO после взаимодействия с пероксидазой через. 15-20 мин становится темнокоричневого цвета. В процессе взаимодействия лизоцима с клеточными стенками Micrococcus lysodeikticus выделяется продукт разрушения, который является конкурентным восстановителем перекиси водорода, входящей в другую фермент-субстратную систему (пероксидаза - 5-АС X Н202). В результате такого конкурентного восстановления перекиси водорода степень срабатывания второго субстрата (5-АС х HjOj) зависит от количества продуктов разрушения стенок Micrococcus lysodeikticus, которое пропорционально количеству определяемого лизоцима. По мере уменьшения концентрации лизоцима происходит нарастание интенсивности окрашивания конечных продуктов реакции, которые через 15-20 мин регистрируются спектрофотометрически при 450 нм. На основании полученных данных строят калибровочную стандартную кривую лизоцима, откладывая на оси абсцисс концентрацию лизоцима в нг/мл, а на оси ординат - оптическую плотность растворов. На чертеже представлена калибровочная кривая. Пример. Определение содержания лизоцима начинают с разведения сыворотки физиологическим раствором в соотношении 1:10. В лунки пластикового планшета вносят по 0,1 мл разведенной сьшоротки и добавляют по 0,05 мл взвеси тщательно растертых в физиологическом

31

растворе стенок Micrococcus lysodeiktLcus в концентрации 1 мг/мл. После 10-15 мин инкубации при комнатной температуре к реакционной смеси добавляют 0,5 мл субстрата на пероксидазу: 0,08%-ный раствор 5-АС с 0,05%-ным раствором перекиси водорода в соотношении 9:1 и через 2-3 мин 0,05 мл 0,04%-ного раствора пероксидазы. Интенсивность окрашивания конечных продуктов через 15-20 мин измеряют спектрофотометрически при 450 нм. Концентрацию лизоцтгма в сыворотке находят по стандартной кривой. Найденную концентрацию умножают на степень разведения и получают содержание лизоцима в иг/мл Оптическая плотность исследуемой сыворотки равна 0,3. По стандартной

«кривой находят, что это соответствует 830 нг/мл лизоцима. Полученную концентрацию умножают на разведение (10) и находят содержание лизоцима в испытуемой еьгооротке, которое равно

,8300 нг/мл или 8,3 мкг/мл.

В таблице приведены результаты опытов по определению содержания лизоцима в биологических жидкостях

784

и тканях предлагаемым способом и известным - методом диффузии в агар.

Результаты этих исследований показывают явное преимущество предлагаемого способа по сравнению с известным. Об эффективности предлагаемого способа свидетельствует и его более высокая чувствительность, позволяющая выявить наличие лизоцима в образцах, которое базовым способом не улавливается.

Таким образом, предлагаемый способ является экспресс-методом, так как позволяет провести определение

содержания лизоцима в испытуемых образцах в течение 45-60 мин, в то время как известным способом - на протяжении 20-22 ч. Предлагаемый способ по сравнение с известным

в 10-20 раз чувствительнее, так как позволяет определить содержание лизоцима в нг/мл по сравнению с мкг/мл известным способом. Кроме того, предлагаемый способ позволяет

проводить быструю и точную инструментальную оценку реакции, что особенно важно в практике клиникр-диагностических лабораторий.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЛИЗОЦИМА путем инкубации биологической жидкости с клеточными стенками Micrococcus lysodeikticus, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа повышения его чувствительности и точности, инкубацию проводят 10-15 мин при комнатной температуре, добавляют раствор 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода, затем прибавляют раствор пероксидазы и спектрофотометрируют.

ыворотка крови 1 2 3 4 5 6 7 8

5000 3150 1000 2600 4150 8000 1550 3150

9 лимфа 6250 10 - 4200

5-60

4,8

20-22 3,0 0,8 2,5 3,8 7,5 Ь5 3.0 6,0 4,0

Предлагаемый способ

Содержание

лизоцима,

нг/мл

омогенаты органов

11500

1

9500

2

7250

3

4

6250

9350

5 олоко

770

1пастеризованное

2нативное

4700

3- 6700

560

А пастеризованное

5750 5 нативное Примечание

Продолжение таблицы

Метод диффузии в агар

Время

Содержание проведелизоцима,

мкг/мл ния испытаний, ч

10

9,0

7,0

6,0

9,9

20-22

Следы

4,0

6,0

Следы 5,0 Исследования проводят, используя сыворотки человека, животных и Гомогенаты тканей животных.