Способ определения креатинкиназы МВ в сыворотке крови Советский патент 1987 года по МПК A61K39/00 

1I

Изобретение относится к способу определения активности креатинфос- фокиназы МБ, называемой СК-МВ, в сьшоротке.

Целью изобретения является повышение точности определения креатин- киназы MB в сьшоротке крови.

Способ осуществляется следующим образом.

Способ определения .креатинкиназы МБ в сьшоротке осуществляется иммунологическим исключением группы М и измерением группы В по известным методам для определения креатинкина- зы. Для исключения группы М в реакционной смеси из антител против группы М добавляют одновалентные фрагменты, полученные протеолитическим расщеплением при восстанавливающих условиях.

Ферменты тормозятся не только природными антителами, которые принадлежат к IgG-фракции или к -глобулинам и имеют молекулярную массу около 130.000-210,000, но и FAB-фрагмента- ми, образующимися в результате проте олитического расщепления.

Пример. Получение IgG-фракции.

Сьгооротка овец, которые подвергнуты иммунизации СК-ММ (мьшечный тип фермента) человека, смешивают с кристаллическим сульфатом аммония при 0-4°С и рН 7 к 1,8 М, После центрифугирования осадок растворяют в 0,1 М ТРIS/0,15 М NaCl - буферном растворе, рН 8, и подвергают диализу относительно избыточного количества 10 мМ фосфатного буферного раствора, рН 7,1. Еще раз осветленный центрифугированием диализат наносят на колонку, которая заполнена ДЕАЕ- целлюлозой. Содержащий протеины поток и элюат, который получсьется с I5 мМ фосфата /1 О мМ NaC1 - буферного раствора, рН 7,1, соединяются и содержат более 95% чистой IgG.

Расщепление папаином.

IgG инкубируют при восстанавливающих условиях (I о мМ цистеина ) с 1,5% папаина (мас.% в пересчете на количество lgG-протеина) при рН 7,5 свьше 5 ч при 37 С..В конце фазы инкубации воздействие фермента прекращается избытком ацетамида иода и для алкилирования свободных SH-групп проводят 2 ч инкубацию при рН 7,5 при комнатной температуре.

0

5

5

0

5

0

5

0

5

Стабилизированная смесь расщепления содержит FAB-фрагменты, F, -фрагменты и 10% нерасщепленной IgG. Быход иммунореакционной способности составляет более 75%.

Очистка FAB-фрагментов.

После концентрации до 30 мг/мл ультрафильтрованием смесь расщепления разделяют методом гель-хроматографии. FAB-фрагменты элюируют как последний протеиновый пик, хорошо отделенный от IgG и F - фрагментов. FAB-фракция после концентрирования ультрафильтрованием может применяться непосредственно для торможения СК-ММ или СК-МВ (мозговой тип). Торможение СК-МБ (гибридный тип) составляет в рамках предела погрешности 50%. Торможение СК-ММ составляет 99-100%.

П р и М е р 2. Получение фракции -глобулина нз плазмы овцы.

Цитратную плазму овец, которые подвергались иммунизации с СК-ММ в течение 4-6 месяцев, разбавляют 25 мМ хлористого кальция и ставят приблизительно на 2 ч при комнатноР температуре для коагуляции. После механического дробления коагулята разбавляют 1 объемом физиологического NaC1-раствора и смешивают для адсорбции липопротеина с 2% силикатного коагулянта (аэрозил).

Центрифугированием получается прозрачный верхний слой. Из верхнего слоя при 0-4°С и при рН 7 осаждается при помощи 1,8 М сульфата аммония фракции - -глобулина и собирается центрифугированием. Диализом относительно 50 мМ ТРIS/0,1 М NaCl- буферного раствора, рН 7,5, и концентрацией ультрафильтрованием получают пригодный для расщепления ферментами препарат антител.

Расщепление папаином.

Работают по 1 , но проводится некоторая модификация для фракции -у-глобулина. 1,5% папаина относятся в 1 г протеина фракции -глобулина, а время инкубации составляет 20 ч при 25°С. Остальные условия одинаковы.

Очистка FAB-фракции.

Алкилированная смесь расщепления подвергается диализу относительно физиологического раствора хлористого натрия, затем смешивается с 25 мМ сульфата цинка. В результате этого

осаждаются остатки нерасщепленных IgG и FJ.-фрагментов и отделяются центрифугированием. Остающиеся FAB-фрагменты после диализа и концентрации готовы для применения в СК-МВ-тесте. Выход составляет более 80% тормозящей активности для СК- ММ-изофермента в пересчете на исходную плазму. СК-МВ тормозится на 50% независимо от величины торможения для нерасщепленных антител.

В таблице показаны результаты, полученные с различными сьшоротками.

Предлагаемый способ позволяет по сравнению с известным, в котором тормоз СК-ММ полностью и СК-МВ на 60-90%, получать одновалентные фрагменты (FAB-фрагменты), которые тормозят .СК-ММ, а СК-МВ тормозят в рамках предела погрешности только до 50%. В результате становится возможным применять полученные от соответствующих подопытных животных(овцы, кролика, курицы и т.п.) антисьюоротки для определения СК-МВ, не выделяя предварительно связанными с затратаРедактор И.Шулла

Составитель Г.Крюкова Техред Л.Сердюкова Корректор В.Бутяга

Заказ 4057/59 Тираж 594Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раущская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул. Проектная, 4

.

1336941

ми аналитическими методами т.ех антисывороток, которые тормозят СК-МВ приблизительно более чем на 53%. Возможно расщеплять сьгооротки без предществующего определения их тормозящих свойств протеолитическим путем при восстанавливающих условиях и исключать затем специфически с 10 фрагментами расщепления группу М СК независимо от того, имеются ли в мьщ1ечном ферменте СК-ММ или в гибридном ферменте СК-МВ.

15Формулаизобретения

Способ определения креатинкиназы MB в сьшоротке крови путем обработки ее антителами к креатинкиназе ММ, отличающийся тем, что, с целью повьщ1ени точности определения, в качестве антител используют одновалентные фрагменты F-AB, вьще- ляемые из фракции IgG или у-глобулина антисьторотки к креатинкиназе ММ, при этом их предварительно обрабатывают ацетамидом йода.

Изобретение относится к способу определения активности креатинфосфо- киназы МБ (СК-МВ) в сыворотке. Цель изобретения - повышение точности определения креатинкиназы MB в сьшоротке крови. Для этого определяют СК-МВ иммунологическим исключением группы М и измерением группы В по известным методам для определения креатинкиназы. Исключают Группы М в реакционной смеси из антител против группы М, добавляют одновалентные фрагменты, полученные протеолитичес- ким расщеплением при восстанавливающих условиях.Фрагменты тормозят не только природными антителами, которые принадлежат к IgG-фракции или к j-глобулинам и имеют молекулярную массу 130.000-210.000, но и FAB-фраг- ментами, образующимися в результате . протеолитического расщепления, из фракции IgG или -глобулина антисыворотки к креатинкиназе ММ, при этом их предварительно обрабатывают ацет- амидом йода. 1 табл. (О СО