Способ получения креатинамидиногидролазы Советский патент 1992 года по МПК C12N15/26 C12N9/78 

Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения креатина- мидиногидролазы,которая стабильнее, чем нативный фермент, и поэтому более пригодна для определения содержания креатини- на в сыворотке, плазме или моче.

Фермент креатинамидиногидролаза ЕС 3.5.3.3 находит промышленное применение для определения креатинина. Его используют для диагноза заболеваний почек, при которых в сыворотке или моче содержание креатинина отклоняется от таковых здорового организма.

Известны микроорганизмы, которые при индукции за счет креатина в состоянии

вырабатывать креатинамидиногидролазу в достаточном для переработки количестве.

Однако достигаемый выход и стоимость фермента представляют собой лимитирующий фактор для промышленного применения фермента.

Известен также способ получения данного фермента, при котором удалось выделитьген,кодирующий креатинамидиногидролазу из Pseudomonas putlda, клонировать его рВР 322. После трансформации микроорганизмов вида Е, coll или полученной рекомбинантной ДНК удалось получить конститутивно креатинамидиногидролазу.

О

Этот способ с помощью генной инженерии креатинамидиногидролазы эффективнее и легче в осуществлении, чем выделение из индуцированного, не содержащего никакого плазмида микроорганизма.

Однако получаемый с помощью данного способа фермент естественного типа обладает только ограниченной детергентной и термической стабильностью и, таким образом, оптимально непригоден для использования в клиническом тест-способе.

Цель изобретения - повышение стабильности фермента.

Получены креатинамидиногидролазы, которые катализируют реакцию: .

Креатин + НаО - саркозин + мочевина.

В отличие от нативного фермента в полученном белке происходит замена аминокислоты в положении 109. Аминокислота аланин заменяется валимом. Полученный фермент обладает намного лучшей стабильностью, чем нативный фермент.

Сконструированы плазмиды рВТ 109 и рВТ 119, содержащие ген креатинамидиногидролазы, в котором произошла аминокислотная замена в положении 109, а в случае рВТ 119 также в положении 355 заменена Val и Met. Благодаря секвенсированию рВТ 119 установлено, что в положении 1063 последовательности в кодирующей нити G заменен на A (G А), тзк что триплет GTG npcBpaajen в АТС. В результате трансформации штаммов рецинентом полученными плазммдами созданы штаммы Е. coll, DSM 4105, содержащие плазмиду рВТ 109, и штамм Е. coll, DSM 4106, содержащий плазмиду рВТ 119, конститутивно экспрессиру- ющие креатинамидиногидролазу.

Пример. Клетки Е. coll DSM 4105, Е. coll DSM 4106 и для сравнения Е. coll DSM 3143 выращивают в течение ночи в фермен- торах на 1 л.

Среда - полная (дрожжи, пентоновый экстракт); 0,4% глюкозы; 100 ммоль/л фосфатного буфера.

После 15-минутного центрифугирования при 8000 об/мин клетки переводят в удобную для переработки форму в French- прессе и креатинамидиногидролазу очищают путем фрекцинированил через молекулярное сито (Софакрил S 200). Полученные ферменты инкубируют при указан- ных в табл. 3 условиях и затем

осуществляют определение фермента при применении тест-комбинации Мочевина (ВМ определение № 124770, табл. 4).

Табл. 1 воспроизводит характер стабильности предлагаемых в изобретении мутантов креатинамидиногидролазы по сравнению с ферментом полученным способом-прототипом при 37°С, причем тест- смесь 1 из тест-комбинации

креатинин-РАР (ВМ - определение № 839 434); исходная активность: 12 У(мл) 100%. Результаты сравнения констант Mlchaells (Км) при 37°С, 0,1 моль/л Трио- HCI, рН 8,0 (оптимальные тест-условия) приведены в табл. 2.

Тест-условия: фосфатный буфер 20 ммоль/л; рН 8,0;

Нативная креатинамидиногидролиза 1,05 мг белка/мл (8,0 V/мг)..

Полученная креатинамидиногидролаза 1,10 мг белка/мл (8,7 V/мг), (аминокислота

109 Val)

Фермент инкубируют при указанных тест-условиях и затем осуществляют определение фермента при тест-комбинациях Мочевина (ВМ определение № 124770).

Полученный фермент обладает большей стабильностью и с помощью данной креатинамидиногидролазы можно избежать потерь активности фермента при определении креатинина и осуществлять надежно такие

определения также через более длительные промежутки времени, на основании улучшенных свойств также возможно уменьшение количества фермента в креагинин-тесте.

Форму л а изобретения

Способ получения креатинамидиногидролазы, предусматривающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей креатинамидиногидролазы,

трансформацию полученной ДНК штамма бактерий Escherichla coll, культивирование трансформированного штамма, выделение и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности фермента, конструируют рекомби- нантную плазмидную ДНК рВТ 109 или рВТ 119, трансформации подвергают штамм E.coll DSM 4105, или DSM 4106. при этом плазмидой трансформируют штамм Е. coll

DSM 4105, а плазмидой рВТ 119 - штамм Е. COII4106.

Таблица 1

Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения креатина- мидиногидролазы, которая стабильнее, чем нативный фермент, и поэтому более пригодна для определения содержания креатини- на в сыворотке, плазме или моче. Целью изобретения является повышение стабиль1- ности фермента. Конструируют плазмиды рВТ 109 и рВТ 119, содержащие ген креати- намидиногидролазы. в котором произошла аминокис потная замена в положении 109, а в случае рВТ 119 также в положении 355 - замена Val на Met. Благодаря секвенсированию рВТ 119 установлено, что в положении 1063 последовательности в кодирующей нити G заменена A/G - А/ так, что триплет СТА превращен вАТб. В результате трансформации штаммов-реципиентов полученными плазмидами созданы штамм Е. col DSM 4105, содержащий плазмиду р ВТ 109 и штамм Е. col I DS М 4106, соде ржа- щий плазмиду рВТ 119, конститутивно экс- прессирующие креатинамидиногидролазу. 4 табл.

Стабильность полученной креатинамидиногидролазы по сравнению с известным

ферментом

Константа Михасталиса ферментов

Определение остаточной активности фермента при оптимальных условиях при различных температурах

Определение фермента при 37 С

Время, Креатинэмидиногидролаза oi-т мин(патент ФРГ V 350018 t A1)

(Д5М ) Сравнение

О3,3 V/мл (активность 100%)

151,9 V/мл (остаточная активность 59$)

300,6 V/мл (остаточная активность - 18%)

600,2 V/мл (остаточная активность 6$)

О3,3 V/мл (активность « 100%)

Таблица 2

Таблица 3

Таблица1)

за мутанта )

ию 100%)

актив

ктив

ктив

100%)

Тест-условия

Тест-смесь I иэ тест-комбинации

Креатииин-РАР (ВМ н- 839 i3 t)

В 125 ммоль/л фосфатного буфера I детергент