Способ определения моноаминооксидазной активности тромбоцитов Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 

д

Эд

Э

:л

Изобретение относится к области биохимии, биотехнологии н медицины,а имен :К способам определения активности фермента в организме, конкретно к способам определения моноаминооксидаэной (МАО) активности, и может быть использовано в медицинской и лабораторной практике, а также в научных целях.

Целью изобретения является повыше.ние точности способа путем определения множественных форм моноаминооксидазы.

Пример осуществления способа, 500 МП донорской крови, содержащей 0,38% цитрата натрия, центрифугируют при в течение 10 мин. Осадок эритроцитов промывают 0,15 М NaCl два раза и отделяют центрифугированием. Объединенные надосадочные жидкости центрифугируют в тех же условиях, отбрасьшая осадок, надосадочную жидкость центрифугируют 20 мин при 650 g. Тромбоциты суспензируют в 0,01 М К - На фосфатном буфере при

рН 7,4. Смесь тромбоцитов центрифугируют 10 мин при 30 TMC.g, надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе в солюбилизирующей смеси,состоящей из 1,3 М мочевины,1,3% тритона Х-100 в О,of М фосфатном буфере при рН 7,4. Через 30 мин смесь центрифугируют 30 мин при 30 TMC.g, обессоливают на колонке с Сефадексом Г-50 (23 -1,2 см) и концентрируют .на ультрафильтре Амикон РМ-30 в 7 раз. Раствор наносят на колонку с афинным сорбентом АН-Сефарозой 4В (13-1,2 см промывают 0,01 М фосфатным буфером при рН 7,4; множественные формы МАО злюируют фосфатным буфером различной концентрации и градиентом концентрации тритона Х-100. Определяя белок и активность моноаминооксидазы (например, с бензИламином в качестве субстрата) в пробах, получают профиль элюции, характеризующий содержание (изоферментный состав) и величину активности трех множественных форм моноаминооксидазы.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОНОАМИНООКСВДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ путем инкубации солюбийизата мембран тромбоцитов бензиламином в качестве субстрата, отличающийся тем, что, с целью повышения точности cifoco6a путем определения множественных форм моноаминооксидазы, солюбилизат мембран наносят, на колонну, заполненную иг-аминогексил сефарозой -4В, далее элюируют белковую фракцию 0,1 М фосфатным буфером при рН 7,4, в полученном элюате определяют с помощью субстрата, форму моиоаминсоксидазы активностью 0,02±0,0t нмоль/мг белка в минуту, далее элюируют тем же фосфатным буфером с добдвлением тритона Х-100 в градиенте концентраций 0,001-0,25%, в полученном элюате определяют форму моноаминооксидазы активностью 1,910,2 нмоль/мг белка. в минуту, далее элюируют 0,4 М фосфатным буфером при рН 7,4 с добавле(Л нием 0,25%-ного тритона Х-100, в полученном элюате определяют форму моноаминооксидазы активностью 1j7 tOj2 нмоль/мг белка в минуту.