Способ выделения моноаминоксидазы Советский патент 1985 года по МПК C12N9/00 

СНОСОВ ВЫДЕЛЕНИЯ МОНОАМИНОКСИДАЗЫ из мозга путем солюбилиэахщи митохондрий неиЬиным детергентом и аффинной хроматографии, о тличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта, солю- билизацию проводят в 0,01-0,05 М фосфатном буфере рН 7,2-7,6 с последующей биоспецифической хроматографией в объеме.

Изобретение относится к биохимии и медицине, а именно к способам выделения высокоочищенных ферментных препаратов, конкретно к способам вьщеления фермента моноаминоксидазы (МАО) из объектов животного происхождения, и может быть использовано в научных целях, применяться в лабораторной и медицинской практике

Цепь изобретения - упрощение про цесса и увеличение выхода целевого продукта.

Пример 1. 500 г мозга быка промывают 0,9% КС1 и гомогенизируют в течение 1 мин при SOOO об/мин (гомогенизатор РТ-1) с 4500 мл 0,25 М сахарозы, к которой добавляю 90 мл Ш KjHPO до рН 7,2. Полученн гомогенат центрифугируют при 1500 g в течение 10 мин на центрифуге ЦПР. Надосадочную жидкость (3350 мл) ценрифугируют в течение 10 мин при 1300 g на центрифуге ЦЛР для осаждения митохондрий. Осадок, полученный после центрифугирования при 1500 g втечение 10 мин, промьгоают 2250 мл 0,25 М сахарозы, рН 7,2, и npohe raHbie воды центрифугируют при 13000 g в течение 10 мин. Полученны осадки митохондрий объединяют, суспендируют в 450 мл бидистиллированной воды и центрифугируют в течение 40 мин при 26000 g на центрифуге ЦВР-1. Полученный осадок, содержащи мембраны митохондрий, промывают два раза 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,2, для удаления белков митохондриального матрикса и суспендируют в бIHимaльнoм объеме того же буфера В полученной суспензии определяют содержание белка при помощи калори метрического метода Лоури.

Суспензию, содержавшую 18,4 мг/мл белка в объеме 210 мл, центрифугируют 30 мин при 34000 g на центрифу ге ЦБР-1. Полученную надосадочную жидкость отбрасывают, а к 130 мл осадка добавляют 257 мл 0,01 М фос:фатного буфера рН 7,2, содержавшего 18,8 МП водного раствора детергента тритон х-100. При перемешивании на холоду (0°) полученную смесь выдерживают 30 мин, а затем центрифугируют при 40000 g в течение 1 ч. Полученную надосадочную жидкость концентрируют методом ультрафильтрации через фильтр Амикок РМ-ЗО до 34 мл. Всего получено 456 г солюбизированного материала, который на воронке со стеклянными фильтрами диаметром 9,6 см обрабатывают 188 мл адсорбента АН-Сефарозы, уравновешенного 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,2, Адсорбент промывают 600 мл этого же буфера, а препарат МАО-1 элюируют 0,1 М фосфатным буфером рН 7,2, собирая фракции по 30 мл. Те фракции, которые содержат белок (общий объем 175 мл), концентрируют в течение 18 ч при помощи Сефадекса Г-200 (сверхтонкий), а затем путем ультрафикадии через фильтр Амикон РМ-30 до объема 30 мл. Препараты МАО-Па элюируют как описано 0,1 М фосфатным буфером, содержавшим 0,09% тритон х-100; МАО-Пб - указанным буфером, содержавшим 0,25% тритон х-100 Регенерацию АН-Сефарозы осуществляют промывкой 0,4 М фосфатным буфером, содержавшим 1% тритон Х-100 и 0,6 М NaCl, а затем 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,2.

Пример 2. 500 г мозга быка промывают 0,9% КС1 и гомогенизируют в течение t мин при 8000 об./мин (гомогенизатор РТ-1) с 4500 мл О,25 М сахарозы, к которой добавляют 90 мл 1М KjHPO до рН 7,6. Полученный гомогенат центрифугируют при 1500 g в течение 10 мин на центрифуге ЦПР. НадосадочнуюЖИДКОСТЬ (3350 мл) центрифугируют в течение 10 мин при 1300 g на центрифуге ЦПР для осаждений митохондрий. Осадок,, полученный после центрифугирования при 1500 g в течение 10 мин, промывают 2250 мл 0,25 М сахарозы, рН 7,6 промывные воды центрифугируют при 13000 g в течение 10 мин. Полученные осадки митохондрий о ъединяют, суспензируют в 450 мл бидистиллированной воды и центрифугируют, в течение 40 мин при 26000 g на центрифуге ЦВР-1. Полученный осадок, содержащий мембраны митохондрий, промывают два раза 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,6, для удаления белков митохондриального матрикса и суспензируют в минимальном объеме того же буфера. В полученной суспензии определяют содержание белка прИ помощи калориметрического метода Лоури.

Суспензию, содержавшую 20,5 мг/мл белка в объеме 188 мл,центрифугируют 30 мин при 34000 g на центрифуre ЦВР-i. Полученную надосадочную жидкость отбрасьюают, а к 130 мл осадка добавляли 257 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,6, содержавшего 18,8 МП 25%-нЬго водного раствора детергента тритон х-100. При помешивании на холоду (0°) полученную смес вьщерживают 30 мин, а затем центрифугировали при 40000 g в течение 1 ч. Полученную надосадочную жидкость кон центрируют методом ультафильтрации через фильтр Амикон РМ-30 до 34 мл. Всего получено 464 мг солюбизированиого материала, который на воронке со стеклянным фильтром диаметром 9,6 см обрабатывают 191 мл адсорбента АН-Сефарозы, уравновешенного 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,6. Адсорбент промьтают 600 мл этого же буфера, а препарат МАО-1 элюируют

0,1 М фосфатным буфером рН 7,6, собирая фракции по 30 мл. Те фракции, которые содержат белок (общий объем 170 мл), концентрируют в течение 18 ч при помощи Сефадекса Г-200 (сверхтонкий), а затем путем аультрафильтрации через фильтр Амикон РМ-30 до объема 30 мл. Препараты МАО-Па элюируют таким же образом 0,1 М фосфатным буфером, содержавшим 0,09% тритон х-100; МАО-Пб тем же буфером, содержавшим О,14% тритон х-100, а MAO-III - 0,4 М фосфатным буфером, содержавшим 0,25% тритон х-100. Регенерацию АН-Ч ефарозы осуществляют промывкой 0,4 М фосфатным буфером, содержавшим 1% тритон х-100 и 0,6 М аС1, а затем 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,6.