(54) ОКТАПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ
СПЕЦИФИЧЕСКИ ИНГИБИРОВАТЬ ПРЕССОРНЫЙ ЭФФЕКТ И МИОТРОПНОЕ ДЕЙСТВИЕ АНГИОТЕНЗИНА II нацией остова пептидной цепи - наличием дополнительной NH-группы между С и карбонильным углеродным атомом в остатке валина в положении 3. Однако это неожиданно усиливает антагонистическое действие этого аналога гормона и снижает нежелйтельный прессорный эффект. Предлагаемое соединение было синтезировано путем конденсации (согласно схеме) отдельных фрагментов при использовании известныхметодов пептидной химии (например азидного,карбодиимидного и пр.) 3. Трет-бутоксикарбонилгидразид бензилоксикарбонил-аспарагинил-Nr -нитроаргинил валина (4) (см. схему 1) получают карбодиимидным методом, конденсируя бензилоксикарбониласпарагинил-№ -нитроаргинин (2) с трет-бутоксикарбонилгидразидом валина (3) в присутствии двух молей 1-гидроксибензотриазола. Защиту гидразидной фунции - трет-бутоксикарбонильную группу соединения (4) - отщепляют трифторуксусной кислотой при комнатной температу, ре. Азид (6), полученный по методу Рудингера из гидразида (5), выдерживают в растворе диметилформамида I ч при 50°С. В таких условиях происходит полная перегруппировка азида в изоцианат (7), который без выделения вводят в реакцию с аминокомпонеЕ1Тной (8). Защитные группы у полученного окт-апептида (9) удаляют каталитическим гидрогенолизом. Диацетат аспарагиниларгинил-аза- -гомовалилтирозил-гистидил- , пролил-фенилаланина (1) чистят, экстрагируя н-бутаНОЛОМ из водного раствора. Получают соединение I хроматографически и электрофоретически однородное, данные аминокислотного анализа продуктов кислотного гидролиза подтверждают наличие аминокислот,, входящих в последовательность октапептида (I), в ожидаемых соотношениях. Пример. В работе используют аминокислоты L-ряда. Органические растворители чистят согласно общепринятым методам. Растворители упаривают на ротационном испарителе при остаточном давлении 12- 15 мм рт. ст. и температуре бани 30-40°С. Температуру плавления (или разложения) соединений определяют в открытых капиллярах без исправления. Удельное оптическое вращение измеряют на цифровом поляриметре «Parkin Elmer (модель 141). Электрофорез проводят , на бумаге FN-16 (ГДР) в 30%-ной уксусной кислоте (рН.1,9) при 18 В/см, электрофоретическую подвижность соединений приводят ро отношению к гистидину (Е«а ). Для нисходящей хроматографии применяют бумагу FN-3 (ГДР) и следующие системы: н-бутанол -пиридин-уксусная кислота-вода при соотношении соответственно 30:20:6:24 (А); н-бутанол-уксусная кислота-вода при соотношении 5:1:2 {Б). Хроматографию в тонком слое (ТСХ) проводят на пластинках«Silufol фирмы «KavaИег (Чехословакия) в системах этилацетатпиридин-уксусная кислота-вода при соотношении 5:5:1:3 (В); хлороформ-метанол- вода при соотношении 40:30:5 (Г); н-бутанол-изо-пропанол-вода-хлоруксуснаякислота при соотношении 65-15:20:3 (Д); н-бутанол-уксусная, кислота-вода при соотношении 4:1:1 (Е); и хлороформ-этанол-этилацетат-вода при соотношении 5:5: : 1,5:0,5 (Ж). Вещества на хромато- и электрофореграммах в зависимости от структуры соединения обнаруживают нингидрином и реактивами Паули, Сакагучи, Рейнделя-Хоппе и Бартона. Для элементного анализа вещества высушивают в пистолете Фишера в течение 24 ч над пятиокисью фосфора при 60°С и остаточном давлении 0,1 мм рт. ст. Кислотный гидролиз пептидов проводят в 6 н. соляной кислоте при 105°С в запаянных ампулах в течение 24 ч. Аминокислотный состав определяют на автоматическом анализаторе ВС-200 фирмы «BiocaU (ФРГ). Трет-бутоксикарбонилгидразид бензилоксикарбонил-аспарагинил-ЬЯ-нитроаргинилвалина- 3. К охлажденному до 0°С раствору 11,7 г (25 ммоль) бензилоксикарбонил-аспарагинил-Г -нитроаргинина и 6,8 г (50 ммоль) 1-гидроксибензотрйазола в 80 мл диметилформамида приливают раствор 5,2 г (25 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 15 мл диметилформамида и выдерживают 1 ч при 4-2°С. Добавляют 5,8 г (25 ммоль) трет-бутоксикарбонилгидразида валина и смесь выдерживают 24 ч при +2°С. Отфильтровывают дициклогексилмочевину, к фильтрату приливают воду до помутнения (около 120 МЛ; 60°С) и выдерживают 15 ч при +4°С Юсадок (дициклогексилмочевину и 1-гидроксибензотриазол) отфильтровывают и фильтрат выливают в смесь, состоящую из 300 мл насыщенного раствора NaCL и 50 мл насыщенного раствора NaHCO. Выпавший мелкий осадок отфильтровывают, промывают водой, затем-суспендируют в 300 мл этилацетата. Отфильтровывают, промывают этанолом (50 мл), водой и высушивают в вакууме над PjOs- КОН. Выход fS,8 г, 92/о, т. пл. 180-185°С (разЛ.). Д/й, а- 22,4/С I, диметилформамид); R 0,88 (А); % 0,85 (Б) RfO,96/(B); Rt 0,78 (Г), EHIS 0,33 (рН 1,9). Найдено: %: С 48,81; Н 6,43; N 20.33. Вычислено, %: С 49,40; Н 6,51; N 20,58. Трифторацетат гидразида бензилоксикарбонил-аспарагинил-М -нитроаргинил-валнна (4). Раствор 13,6 г (20 ммоль) (3) в 50 мл трифторуксусной кислоты выдерживают 30 мин при 20°С , затем в вакууме (12мм, 20°С) отгоняют 35 мл трифторуксусной кислоты, остаток растирают с эфиром, выпавший в осадок продукт отфильтровывают и сушат в вакууме над PjOe/KOH. Выход 13,5 г (98%), т.-пл. 191 -193°С (разл.).. - 10,3(CL, диметилформамид); RiO,75 (А), R 0,67 (Б), Rr 0,73 (Г), foO,93 (В), ЕНВ 0,47 (рН 1,9) Найдено, «/о: С 43,64; Н 5,57; N 20,34. Вычислено, %: С 43,22; . Н 5,37; N 20,02. Ci,H,,,COOH п-Нитробензиловый эфир трет-бутоксикарбонил-0-бензилтирозил-валил-гистидилпролил-изолейцина 02). К раствору 6 г (10ммоль) п-нитробензил вого эфира валил-гистиднл-пролйл-изолейцина в 50 мл (диметилформамида) прибавляют 6 г (12 ммоль) п-нитробензилового эфира трет-бутоксикарбонил-0-бензилтирозина, 0,5 г 1-гидроксибензотриазола и выдерживают при 20°С 15 ч. К реакционной смеси прибавляют 0,1 мл (3 ммоль) N, N-диэтилендиамина, перемешивают в течение 15 мин и смесь вливают в 400 мл этилацетата и промывают последовательно 15°/о раствором KHSO водой, 10%МаНСОз, водой и высушивают над NatSO /MgSO. Растворитель упаривают до объема 50 мл и (12) высаживают в виде аморфного вещества смесью эфир-гексан при соотношении (1:1). Выход 8,2 гр (8651), т. пл. 106-109°C/i4)-24 (С 1, диметилформамид); R 0,78 (Г),Я 0,57 (Д). Найдено, %: С 63,24, Н 6,82, N 11,14. Вычислено, %: С 63,01; Н 6,77; N 11,76. CsoHetfl lfOn Дихлоргидрат п-нитробензилового эфира О-бензилтирозил-валил-гистидил-пролилизолейцина (13). 8 гр (8,2 ммоль) (12) растворяют в 50 мл ледяной уксусной кислоты, прибавляк)т 50 мл 2 Н. раствора HCL в уксусной кислоте, выдерживают при 20°С 15 мин, упаривают (30°), остаток растирают с эфиром, отфильтровывают и высушивают над KOH/F Qy . Выход 7,5 г( 965I&), т. пл. 138-140°С. Mg - 19,9 (С 1, диметилформамид); EifiS 0,66 (рН 2,4), Rf 0,25 (Д). Найдено, %: С 58,49 , Н 6,22; N 12,48. Вычислено, %: С 58,37; Н 6,31; N 12,01. ,О,2НС1 п-Нитррбёнзиловьш эфир бензилоксикарбонил-аспарагинил-1 -нитрраргинил-аЗачЛ-гомовалил-О-бензилтирозиЛ-валил-гистидил-пролил-изолейцина (14). К раствору 2,43 г (3,5 ммоль) (4) в 15 мл диметилформамида прибавляют 2 мл 7 н раО вора .HCL в диоксане (14 ммоль), реакционную смесь охлаждают до -20°С, прибавляют 0,55 мл (4 ммоль) третбутилнитрита, вы-держивают 20 мин при -15°С и вливают в 200 мл охлажденного до -5°С раствора KCL. (При дальнейшей обработке температуру раствора азида поддерживают не выше +3 ) Азид (5) экстрагируют этилацетатом (2 раза по 200 мл), промывают последовательно водой, 5% раствором NaHCQj, водой, высушивают над (10 мин) и упаривают досуха в вакууме (5°С, 0,1 мм рт. ст.) Остаток растворяют в 30 мл диметилформамида, 15 мин встряхивают с размельченными молекулярным ситами А5(2 гр), отфильтровывают и фильтрат выдерживают 1 ч при 50°С (в течение первых 15-20 мин выделяются пузырьки азота). Полученный раствор гзоцианата (6) прибавляют к раствор2,23 гр (2 ммоль) трифторацетата п-нитробензи лового эфира о-бензилтирозил-валилгистидил-пролил-фенилаланина (7) и 0,55 мл (4 ммоль) триэтиламина в 12 мл диметилформамида и выдерживают 15 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь выливают в 200 мл воды, объемистый осадок отфильтровывают, промывают последовательно 5% раствором NaHCOi, водой, раствором KHSO, водой. Влажный продукт суспендируют в этилацетата, отфильтровывают, промывают этанолом (30 мл), высушивают и переосаждают из диметилформамида - этанол-вода. Высушивают в .вакууме над P«O,/KOH. Выход 1,92 гр (62%), считая на аминокомпоненту, т. пл. 187-190°С (разл.). /«ti,2 2 - 22 (С 1, диметилформамид); %0,93 (А Rf 0,95 (Б), R/0,67 (Г); RiO,54 (Д); Ен 0,48 (рН 1,9) Найдено, %: С 57,94, Н 5,96; N Вычислено, %: С 57,66; Н 6,33; N Сев Нвз Nf7 О/г Аспарагинил-аргиннл-аза- t-гомо-валил-тирозил-валил-1 истидил-пролил-изолейцин (15). К раствору 1,8 г (1,24 ммоль) (6) в 40 мл смеси метанол-уксусная кислота-вода (6: :1:1) прибавляют 1 гр палладиевой черни и гидрируют 24 ч, катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают до объема 5 мл приливают 50 мл абсолютного этанола и сно-. ва упаривают до объема 5 мл. Упаривание этанола повторяют еше 2 раза, образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают этанолрм и эфиром. Полученный продукт растворяют в 100 мл воды и после насышения н-бутанолом промывают 2 раза по 5 мл н-бутанола ij н-бутанрлом экстрагируют октапептид (9) (3 раза по 150 мл). Объединенные экстракты упаривают в вакууме (30°С, 12 мм рте. ст) (до объема 15 мл, остаток растирают с этанолом, осадок отфильтровывают и высушивают, в вакууме над РгОу (КОН при 60°С. Выход 1,1 г (80%), т. пл. 195-197°С (разл.). ,9 (С I, 1 н. CHjCOOH), RiO,24 (А).Rf 0,12 (Б). RrO,12 (Г); Rr 0,08 (Д); ЕНЙ 0,75 (рН 2,4). Найдено: %: С 50,76; Н 6,99; N 18,64. Вычислено,% С 51,19; Н 7,43; N 18,65. С4 Нгз N««O« CHjCOOH ЗНгО . Аминокислотный состав: 0,9; Aggrg 0,9, Val 1,0; Туг 0,9; His 1,1; Pro 0,9; lie 1.0. Полученные соединения октапептид-(Г-аспарагин, 3-аза-({-гомовалин, 5-валин, 8-изолейцин) ангиотензин II испытывают на ингибирование специфической миотропной активности ангиотензина II в опытах in vitro и понижение его эффекта на кровяное давление крыс в опытах in vivo. Методика исследования. Миотропные свойства (1-аспарагин, 3-аза-с(-гомовалин, 5-валин, 8-изолейцин) ан гиотензина И в опытах in vitro изучали согласно методике, регистрирующей изотонические сокращения восходящей ободощной кишки (colon ascendens) крыс, являющейся наиболее чувствительным тест-органом для исследования миотропнойактивности ангио: тензина II. Использован прибор ВИ6-5МА в нашей модификации. Антагонистические свойства изучены в диапазоне концентраций - 10 ммол /л, время предварительной экспозиции кишки с исследуемым соединением составило 3 мин. При вычислении кумулятивных кривых концентрация-эффект (КККЭ) применена машинная обработка экспериментальных данных (каждая точка определялась как средняя из 6-10 опытов) .с определением доверительных интервалов при Р 0,05. Для количественной-характеристики кон курентного антагонизма (1-аспарагин, 3-аза Х -гомовалин, 5-валин, 8-изолейцин)- ангиотензина II вычислены параметры pAj. В опытах in vivo регистрируют кровяное давление у наркотизированных уретаном крыс. После предварительной (1 мин) инъекции исследуемого соединения в дозах 10,50, 100, 250 и 500 мгк/кг животным вводят ангиотензинамид в стандартных дозах 0,05, 0,5 и 5,0 и 25 мкг/кг. Антагонизм соединения исследован также при инфузионном .его введении 10 и 100 мгк/кг/мйн в течение 20 мин. Вычислены кривые доза-эффект для ангиотензина в присутствии и в отсутствии антагониста. Результаты В опытах на изолированной восходящей ободошной кишке крыс (1-аспарагчн, 3-аза- -гомовалин, 5-валин, 8-изолейцин) ангиотензин,II в концентрациях - не проявляет миотропное действие, но в концентрациях порядка - моль вызывает прогрессивное параллельное перемещение кумулятивных кривых концентрация-эффект ангиотензина II в сторону высших концентраций, т. е. проявляет типичный конкурентный антагонизм с ангиотензином. Вычисленные параметры pAj составляют 9,70±0,20. В опытах in vivo соединение I значительно антагонизирует прессорное действие ангиотензина II. При инъекционном введении (З-аза-оС-гомовалин, 8-изолейцин) -ангиотензина в доз 50 мкг/кг требуется 10кратное увеличение дозы ангиотензина и 100-кратное при дозе 100 мкг/кг. Инфузия антагониста со скоростью 10 мйг/кг/мин перемещает кривую доза-эффект ангиотензина на 1 .порядок (10-кратно), ЮОмкг/ /кг/мин - на 2 порядка (100-кратно). Формула изобретения Октапептид формулы L-Asn-L- Ar -ага-ct-homo- L -Val-Туг-L-Уаэ;-L-His-L-Pro-С-Heобладающий способностью специфически ингибировать прессорный эффект и миотропное действие ангиотензина И. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Regoli D., Park W. К., Rioux F,Phar nacology of angiotensin, Pharmacol. Rev., 1974. 26, c. 69. 2.Pettinger W. A., Mitchell H. C. Clinical pharmacology of angiotensin antagonists, Federation Proc., 1976, 35, c. 2521. 3.Шредер Э., Любке К., Пептяды. М., «Мир, 1967, с. 116.
g
S
i
g
tvj
t
M
