Способ гетерогенного иммуноферментного анализа антигена Советский патент 1987 года по МПК G01N33/535 G01N33/551 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и медицине и может быть использовано для определения антигенов в биологических и других объектахб

Иммунологический метод анализа с использованием антител, меченных ферментом, (иммуноферментный анализ.) получает все большее распространение благодаря простоте, высокой чувствительности и отсутствию необходимости работы с вредными для здоровья вёществамИс Наиболее широко используется метод гетерогенного иммуноферментного анализа, при котором соединение антитела с ферментом (конъюгат) присоединяют к поверхности твердой фазыо Существующие способы гетерогенного иммуноферментного aHanHJза различаются типом фермента, использованного для получения коньюгата.

Известны способы гетерогенного иммуноферме нтного анализа антигенов с применением р -галактозидазы, пер- оксидазы, каталазы, глюкозоксидазы, амилазы и Л 5,3-катостероидизомеразы 1-5.

Однако субстраты зтих ферментов сложные органические соединения, нестойкие при хранении. Визуальный анализ результатов определения при низкой концентрации антигена обычно затруднен из-за невысокой интенсивности окраски или высокой величины фона

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ гетерогенного иммуноферментнйго анализа антигена, включающий получение конъюгата специфического антитела и фермента, присоединение коньюгата и определяемого антигена из образца к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение количества антигена в образце визуально или колориметрически о В качестве фермента в этом способе используют щелочную фосфатазу, а в качестве субстрата - пнитрофенилфосфаТо Для получения коньюгата специфического антитела и щелочной фосфатазы их смесь обрабатывают глутаровым альдегидом, после чего избыток последнего удаляют диализом или гельфильтрацией Для присоединения вируса к поверхности

твердой фазы в пластмассовый сосуд помещают на несколько часов раствор специфического антитела, промывают сосуд буферным раствором, а затем помещают в него раствор образца, в котором требуется определить содержание антигена. Последний присоединяется к стенкам сосуда в результате взаимодействия с адсорбированными на них специфическими антителами. Затем в сосуд помещают раствор конъюгата специфического антитела с щелочной фосфатазой, в результате чего конъюгат связьшается с антигеном в количестве,пропорциональном содержанию последнего в образце После этого прибавляют раствор субстрата, п-нитрофенилфосфата и инкубируют с ним. Продукт ферментативной реакции является п-нитрофенол, количество которого измеряют колориметрически при 405 нмо При количественном определении используют калибровочный график, который получают, беря вместо образца растворы антигена известной концентраций. Качественно присутствие антигена в образце определяют визуально по пояйлению желтой окраски

Недостатком способа является невысокая чувствительность, связанная с тем, что продукт реакции - п-нитрофенол , имеет невысокий коэффициент экстинкции (15000 м и возникакщая желтая окраска плохо воспринимается визуально. Допустимый срок хранения субстрата в растворенном виде составляет около 1 недели в твердом виде субстрат заметно разлагается даже при хранении при пЪниженной температуре, что приводит к возрастанию фона. При определении активности щелочной фосфатазы используют высокую концентрацию субстрата (Ш мМ), что связано с высоким значением константы Михаэлиса (1-3 мМ)

Цель изобретения - повышение чувсвительности и уменьшение расхода субстрата.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу гетерогбнного иммуноферментного анализа антигена, включающему получение конъюгата специфического антитела и фермента, присоединение конъюгата и, определение антигена из образца к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение количества антигена в образце, в качестве фермента используют неорганическую пирофосфатазу, а в качестве субстрата - соль пирофосфорной кисло ты в концентрации 0,02-0,5 мМ, Сущность изобретения заключается в использовании неорганической пирофосфатазы вместо щелочной и. соли пирофосфорной кислоты вместо п-нитро фенилфосфата. Продуктом ферментатив. ной реакции в предлагаемом способе является ортофосфат, для определения которого используется цветная реакция, изменение коэффициента экстинк:ций для которой составляет около 70000 , что в 4,6 раза выше, чем для п-нитрофенола. Кроме того, измеряемая окраска изменяется от бледно-желтой в отсутствие опред ляемого антигена до ярко-синей в его присутствии, что наиболее благоприятно для визуальной оценки результатов анализа,, В сумме эти два фактора значительно увеличивают чувствительность определения, особенно при качественном анализе наличия низких концентраций определяемого антигена. Со1ль пирофосфорной кислоты, используемая вкачестве субстрата, устойч „„ „ . ва неограниченное время в твердом состоянии, до 1 года в растворе при и до 2 месяцев в растворе при комнатной температуре. Константа Михаэлиса для неорганической пирофосфатазы по пирофосфату составляет около 5 мкм, по причине чего можно использовать концентрацию субст рата 50 мкм, что в 200 раз меньше, чем для щелочной фосфатазы. Преимуществом изобретения является также высокая стабильность фермента, который не изменяет активност в течение трех лет при комнатной тем пературе, и значительно меньшая Стоимость субстрата П р и М. е р 1 о Определение анти гена вируса крапчатности гвоздики. тт Получение конъюгата антител и неорганической пирофосфатазы. К 1 мл раствора 0,5 мг неорганической пирофосфатазы с удельной активностью 600 ед/мг, выделенной из.Е,coli, и 0,5 мг антител к вирусу крапчатости вьщеленных из сыворотки иммунизирова ного кролика и очищенных осаждением полиэтиленгликолем - 6000 и диззоло в буфере, содержащем 0,025 М окси- этилпиперазинэтансульфокислота - Na (рН 7,5) и 0,1 М NaCl прибавляли 0,05 мл 1%-ного раствора глутарового альдегида в воде и инкубировали смесь 1 Ч при 20°Са Избыток глутарового альдегида удаляли гель-фильтрацией через колонку 1,5x10 см с Сефадексом G 50, уравновешенным 0,1 М буфером трис-HGl (рН 7,2) при , Доля крнъюгата в полученном препарате, по данным электрофореза в полиакриламидном геле, составляла около 40%, остаточная активность неорганической пирофосфатазы - 42%. Построение калибровочной зависимости В углубления микроплата для иммунофермёнтного анализа последовательно вносили по 0,2 мл раствора антител к вирусу крапчатости гвоздики (2 мкг/мл) в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,4) с 0,15 М NaCl с инкубацией в течение 18 ч при , по 0,2 мл суспензии очищенного вируса (1 мкг/мд) в 0,01 трис-НС (рН 7,4), содержанием 0,15 М NaCl и 0,1% твин-20, с инкубацией в течение 1 ч при 37 С, и по 0,2 мл раствора ,п ,т- / конъюгата (0,15 ед/мл) в том же бу « / фере с инкубацией в течение 2 ч при 20 С. После инкубации микроплата с каждым из перечисленных компонентов микроплат про№1вали 3 раза 0,01 М буфером трис-НС (рН 7,4), содержащем 0,15 NaCl и 0,1% твин-20, Затем в лунки вносили 0,2 мл раствора с указанной ниже концентрацией и MgCls (5 мМ) в 0,1 М буфере трис-НС (рН 9,0) и инкубировали 1 ч при 20 С. Реакцию с субстратом останавливали прибавлением 0,05 МП окрашивающего реагента следующего состава, мас.%: молибда т аммония 1,3; краситель малахитовый зеленый 0,07; твин-20 О,15;серная кислота 20; остальное вода. Через 10 мин измеряли оптическую плотность при 630 нм с помощью денсито метра. Для получения сравнительных данных параллельно производили определение вируса в этих же препаратах известным методом. В табл.1 приведены данные для ряда известных концентраций антигена.

Таблица 1

СПОСОБ ГЕТЕРОГЕННОГО ИММУНО,ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА. АНТИГЕНА, включающий получение конъюгата специфического антитела и фермент1а, присоединение коньюгата и определение антигена из образца к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение количества антигена в образце, отличающийс я тем, что, с целью повьшения чувствительности и уменьшения расхода субстрата, в качестве фермента используют неорганическую пирофосфатазу, а в качестве субстрата соль пирофосфорной кислоты в концентрации 0,02-0,5 (Л сд 00 со Сдд СО

Как видно из таблицы, оптическая плотность, измеренная пpeдлaгae в Iм способом, выше, чем измеренная известным способом. Видно также, что оптическая плотность в присутствии антигена возрастала с увеличением концентрации субстрата. Однако при этом возрастала также величина оптической плотности в отсутствие антигена (фон), При концентрации соли пирофосфорной кислоты 0,02 и 0,05 мМ оптическая плотность была стабильная в течение 1 ч, а при концентрации 0,5 мМ - возрастала на 0,1 - 0,2 единшсыо Таким образом, оптимальная концентрация соли пирофосфорной кислоты составляет около 0,05 мМ

При визуальном анализе было обнаружено, что окраска проб изменяется от бледно-желтой в отсутствие антигена до ярко-синей при высокой концентрации антигена. Окраска в пробах с оптической плотностью вьше 0,1 достоверно отличалась от окраски фонае В известном способе окраска изменяется от бесцветной в отсутствие антигена до желтой в присутствии антигена и окраска проб, достоверно отличается от окраски фона лишь при оптической плотности вьш1е 1 единищл.

Определение вируса крапчатности гвоздики в листьях гвоздикио Предлагаемым способом известно содержание вируса в экстрактах двух образцов листьев,

В табло 2 представлены полученные 25 данные

Таблица 2

Как видно из таблицы, два способа дают близкие значения. Предлагаемым способом наличие вируса в обоих образцах видно визуально, тогда как известным способом этого сделать нельзя и обязательно использование денситометра4

П р и м е р 2, Определение 13 S-глобулина семян гречихи.

Способ осуществляли согласно примеру 1, используя антитела к 13 Sглобулину семян гречихи и концентра0 ццю Ка,Рг01 10 0,05 мМ

Данные, полученные для ряда концентраций 13 S-глобулина семян гречихи, следующие:

КонцентрацияОптическая

5 13 S-глобулинаплотность

семян гречихи,

мкг/л.

О

0,075 71 2,20,137 6,70,218 , 200,576 601,225 Технико-экономическая эффективность изобретения заключается в увеличекии чувствительности, иммунофер1589338ментного анализа и уменьшению рас7СОДОВ на субстрат благодаря использованию более дешевого и стабильного при хранении субстрата и уменыпения 5 потребляемого количества. Изобретение создает возможность для широкого внедрения иммуноферментного анализа и уменьшает потревность в дорогостоящем денситомет 10 ре.