Способ гетерогенного иммуноферментного анализа антигена Советский патент 1987 года по МПК G01N33/573 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и медицине и может быть использовано для определения антигенов в биологических и других объектах.

Иммунологический метод анализа с использованием антител, меченных ферментом (иммуноферментный анализ), получает все большее распространение благодаря простоте, высокой чувствительности и отсутствию необходимости работы с вредными для здоровья веществами. Наиболее пшроко используется метод гетерогенного иммунофермент- g ного анализа, при котором соединение антитела с ферментом (коньюгат) присоединяют к поверхности твердой фазы Существующие способы гетерогенного иммуноферментного анализа различаются, главным образом типом фермента, использованного для получения коньюг та. Известны способы гетерогенного иммуноферментного анализа антигена с применением р-галактозидазы, пероксидазы, каталазы, глюкозоксидазы, амилазы и дЗ, 3-кетостероидизомеразы. Субстраты этих ферментов - сложны органические соединения, нестойкие при хранении. Визуальный анализ резу татов определения при низкой концентрации антигена обычно затруднен из-за невысокой интенсивности окраск или высокой величины фона. Наиболее близким по технической сущности является способ гетерогенно го иммуноферментного анализа антиген включающий получение коньюгата специ фического антитела и фермента, присоединение определяемого антигена из образца и коньюгата к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение количества антигена в образце визуально или колориметрически. В качестве субстрата в этом способе используют п-нитрофенилфосфат. Для получения конвюгата специфического антитела и щелочной фо.сфатазы их смесь обрабатывают глутаровым альдегидом, после чего избыток последне1 О удаляют диализом или гельфильтрацией. Для присоединения антигена к поверхности твердой фазы в пластмассовый сосуд помещают на не- gg сколько часов раствор специфического антитела, промывают сосуд буферным раствором, а затем помещают в него раствор образца, в котором требуется

определить содержание антигена. Последний присоединяется к стенкам сосуда в результате взаимодействия с адсорбированными на них специфическими антителами. Затем в сосуд помещают раствор коньюгата специфического антитела с щелочной фосфатазой, в результате чего коньюгат связывается с антигеном в количестве, пропорциональном содержанию последнего в образце. После этого прибавляют раствор субстрата, п-нитрофенилфрсфата и инкубируют с ним. Продуктом ферментативной реакции является п-нитрофенол. количество которого измеряют колориметрически при 405 нм. При количественном определении используют калибровочный график, который получают, беря вместо образца растворы антигена известной концентрации. Качественно присутствие антигена в образце определяют визуально по появлению желтой окраски. Однако недостатком способа является невыская чувствительность, что связано с тем, что продукт реакции, п-нитрофенол, имеет невысокий коэффициент экстинкции (15000 ), и возникающая желтая окраска плохо воспринимается визуально. Допустимый срок хранения субстрата в растворенном виде составляет около 1 недели, в твердом виде субстрат заметно разлагается даже при хранении при пониженной температуре, что приводит к возрастанию фона. При определении активности щелочной фосфатазы использз т высокую концентрацию субстрата (Ю мМ), что связано с высоким значением константы Михаэлиса (1-3 мМ), Целью изобретения является повышение чувствительности и уменьшение расхода субстрата. Поставленная цель в способе гетеро- генного иммуноферментного анализа антигена, включающем получение коньюгата специфического антитела и фермента, присоединение определяемого антигена из образца и коньюгата к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение количества антигена в образце визуально или колориметрически, достигается тем, что в качестве субстрата используют раствор соли пирофосфорной кислоты в концентрации 0,02-1 мМ. Таким образом, сущность изобрете-. ния заключается в использовании раствора соли пирофосфорной 5сислоты вместо п-нитрофенилфосфата. Продуктом ферментативной реакции в описываемом способе является ортофосфат для определения которого используется цветная реакция, изменение коэффициента, экстинкции для которой составляет около 70000 М см , что в 4,6 раз BbiBie, чем для п-нитрофенола. Поэтому, несмотря на то, что скорость образования ортофосфата из соли пирофосфорной кислоты равна 40% скорости образования п-нитрофенола из п-нитрофенилфосфата, измеряемая оптическая плотность в описываемом, способе в 1,8 раза вьше. Кроме того измеряема окраска изменяется от бледно-желтой в отсутствии определяемого антигена до ярко-синей в его присутствии, что наиболее благоприятно для визуальной оценки результатов анализа. В сумме эти два фактора значительно увеличивают чувствительность определения, особенно при качественном анализе наличия низких концентрацией определяемого, антигена. Соль пирофосфорной -КИСЛОТЫ, используемая в качестве субстрата, устойчива неограниченное время в твердом состоянии, до 1 года в растворе при °С и до 2 месяцев в растворе- при комнатной температуре. Константа Михаэлиса для щелочной фосфатазы по пирофосфат-иону составляет около 15 мкм, по причине чего можно использовать концентрацию соли пирофосфорной кислотыiOO мкм, что в 100 раз меньше чем для п-нитрофенил- фосфата.

Преимуществом изобретения является также значительно меньшая стоимость субстрата, - .

Пример 1, Определение антигена - вируса У картофеля,

Коньюгат антител к вирусу У и щелочной фосфатазы кишок теленка получали обработкой их смеси водным раствором глутарового альдегида в концентрации 0,1 мас,%, В углубления микроплаты для иммуноферментного анализа последовательно помещали на 1015 ч при 4С по 0,2 мл раствора анTHjen (2 мкг/мл) в карбонатном буфере рН 9,6, исследуемого экстракта или суспензию очищенного вируса У в 0,1-М буфере трис-НС1 рН 7,5, раствора коньюгата (0,3 ед/мл) в 0,1 М буфере трис-НС1 .рН 7,5 с промежуточной промывкой раствором твин-20 (0,1 мас,%)

и водой, прибавляли 0,2 мл раствора ,3,0, 10H,j,0 в 0,1 М буфере трисНС1 рН 8,5 и инкубировали 15 мин при , Реакцию с субстратом останавливали прибавлением 0,05 мл окрашивающего реагента следующего состава, мас,%: молибдат аммония 1,3, краситель малахитовый зеленый 0,07, твин20 - 0,15, серная кислота 20, остальное - вода. Через 10 мин измеряли оптическую плотность при 630 нм с помощью денситометра,

Для получения сравнительных данных параллельно производили определение вируса У в образцах известным методом, используя те же препараты антител и коньюгата. Раствор, субстрата содержал 10 мМ п-нитрофенилфосфата, Г М диэтаноламин-НС1 рН 0,8 и 0,5 мМ MgClg, Для остановки реакции с субстратом прибавляли 0,05 мл 4 М водного раствора NaOH, Оптическую плотность измеряли при 405 нм.

Данные для ряда известных концентраций вируса У (калибровочные зависимости) сведены в т,абл, 1,

Таблица

Как видно из табл,1, оптическая плотность, измеренная предлагаемым способом, вьше чем измеренная известным способом. Видно; также, что оптическая плотность в присутствии антигена возрастает с ростом концентрации соли пирофосфорной кислоты. Однако при этом возрастает также величина оптической плотности в отсутствии антигена (фон). При концентрации соли пирофосфорной кислоты 0,02 и 0,1 м оптическая плотность стабильна в течение часа, а при концентрации 1 мМвозрастает на 0,2-0,4 едииицы. Таким образом, оптимальной является концентрация 0,1 мМ. I, При визуальном анализе обнаружено что окраска проб изменяется от бледно-желтой в отсутствии антигена до ярко-синей при высокой концентрации антигена. Окра.ска в пробах с оптической плотностью вьппе 0,15 достоверно отличается, от окраски фона. В известном способе окраска изменяется от бесцветной до желтой, и окраска проб достоверно отличается от окраски фона лишь при оптической плотности выше 1 единицы. При определении содержания вируса У в экстрактах двух образцов листьев картофеля следующие ре зультаты, приведенные в табл. 2. Как видно, два способа дают близкие значения. Предлагаемым способом наличие вирусаУ в образце 1 определяется визуально, тогда как в извест ном способе обязательно использовани денситометра. Таблица2 Пример2. Определение 13 S-глобулина семян гречихи. Способ осуществляется согласно примеру 1, используя антитела к 13Sглобулину семян гречихи и следующие концентрации ингредиентов окрашивающего раствора, мас.%: молибдат аммония 0,3, малахитовый зеленый 0,017, твин-20 -0,04, серная кислота 1 н. Ниже приведены данные,полученные для ряда концентраций 13S-глобулина семян гречихи. Концентрация 1ЗЗ-глобу- Оптическая лина семян гречихи, плотность мкг/л О0,06

СНОСОВ ГЕТЕРОГЕННОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА АНТИГЕНА, включающий получение коньюгата специфического антитела и фермента, присоединение определяемого антигена из образца и коньюгата к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение количества антигена в образце визуальноили колориметрически, отличающийс я тем, что, с целью повьшения чувствительности и уменьшения расхода субстрата, в качестве субстрата используют раствор соли пирофосфорной кислоты в концентрации 0,02-1 мМ. (Л