Производное сефарозы 4 @ с аффинантом- @ (11 @ ,17 @ )-11,17-дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-ил @ тио @ уксусной кислоты,как биоспецифический сорбент для аффинной хроматографии Советский патент 1985 года по МПК C07J5/00 C07J31/00 B01D15/08 

CONH|Cfi,)(,NHCH,CH(OH)CK;;OF

но

Oil

Производное сефарозы 4В с аффинантом

где i - ос1аток сефарозы 8,, к а к б я с1 с пе - г нфич е с к с NIV с о р f с 11 v жЬфинной хроматотрафпт-,

звесгны аффилныо copoeiiTU,. исполг яуемые для зьи еления vpa/ic-корги: ;;, которых заключается в активации ссфарозм, во тп5едеди;1 п р о с т р а и с т в е н н о и в с т а в к i; (п о л и с дпучя первичными аминогруп-:iaMi) I у присое;,и11СИ ги афсШчнаята (произвоциоо кпртикос1Ч:р1 мда , (.-Cjiaд аюи fc 1- с п о т в е т с т п уюц; ми 11 а i j а iK т Р г; Ми, сродства к TDaiicKopTii-:V ; | j г- ., Б 5 о л ь и н с т в е с.п у -i а е i . л,л я а к i:: нации сефарозь; используется бромдиач, а V. кггчестве аффииалта М-гемисукгшнат кортизол ;3 J - /j с различ гямк в пространсГБслгмЫх всга-зках, Изомочери 1ньп стт)уктур-иый фрагмемт, связутспптй прг)ст1;аисгпеаную вставку с сефагзозой, ппдзер;.ан п-гдролизу в интерна/сг рИ DJ. Кроме TOICI . а-гот :iparмент в 1рисутствни CBo5o;uibix ar.ii noгрутш, присупщх сывороточным r.:io;;iyлинам, ведет к образованию М,М-днзамещенных гуанид-инюв с отщегшенис-м лиганда от сефарозы б 1. Сложноэфирная связь 21-гемисукцината кортизол L2j и 7 подвержена ферментатргвгюму рас1 1еплению, для предотвращения которого доводят рН исходной сывороки до 5 или осуществляют предварительное старение сыворотки в течение 1-2 мае.

осуп оствляот;; я апш;. иглсличает )о,и- ; и о А FCai K;i .

Од1:ако jijMiMtMfeHiit; сци-а, К(Пэт:-53ола coxpaiwe-r TsO3i. , Kliv для KicJi(i;j,;(3-ocnoBHorc, та:; и д;1я фер -1ента: ИВ 1ого 3 рас:цепле:П1я с,(жноэфириой связи гемисукцината эстеразами сызоро1ки крови.

Таким образом, афинные сор(; :лт1-, гpи ieляeмllle, ,1.;;я выделения белко;: ,. подвергалггся paapyurepiHio н усл(Л;иях биос11едифл1;есксй хромаиографии . что зиачител,но сокращает сро;: сл -жг:-, аффинногг) сорбента (,яо более 1рех выделений, потеря емкости 50()%,) и требует длительных лодгс о и тельнЛ);х операдий (старение, пведание и подлержан 1е pil и т.п.) } процесс С: г.Ь1Л, .

Наиболее (слизкой к изобретению Т.Ляется афгЬ1;нная матрица, синтез трнапная путем иммобилизации геми-с у к ци н а т а к ci р т и з ол а на с ефа р о з у 43, активированную бромцианом. через 3,3 -зиаминодипропиламин L7J.

Хотя ка данном аффинном сорбенте возможно выделение транскортина, однако он отличаетея низкой стабильностью. Так, при рН выше 5,5 (pfi сыворотки крови 7,4) гемисукцинат кортизола может частично гидролизоваться под действием сьшоротки крови в течение Г-2 ч. Частичное высрзобождение кортизола делает невозможным выделение транскортииа. Поэтому необходимо выдерживать сыворотку крови перед выделением из, нее транскортина при рН 5,5 минимум 1-2 мес.

s-CH2Cora(cH2)gMCH2CH(OH)cii20p

г

со

НОу-х1Л:сгг

о

где Р - остаток сефарозы 4В,

как биоспецифическим сорбентом для

аффинной хроматографии.

Способ получения предлагаемого соединения заключается в том, что гель модифицированной сефарозы, полученный последовательной обработкой эпихлоргидрином-и гексаметилендиамином в присутствии едкого натра, подвергают взаимодействию в поднодиоксановой среде с ангидридом ( 1 УСХ )-1 1 ,1 7-дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-ил1-тио1 уксусной кислоты с последчтощей отмык зй водным диоксаном, раствором бикарбоната натрия и дистиллированной водорТ;. Предлагаемая матрица является более устойчивой к биохимическим средам в силу отсутствия химических связей чувствительных как к химическому, так и к ферментному расщеплению. Пространственная вставка, построенная последовательностью C-S-C, CO-N, С-С, C-N, С-О-С связей, обеспечивает наиболее благоприятное расстояние между аффинантом и подложкой (13-15 А). Конформационные и стерические параметры вставки оказывают незна-t чительное влияние на гшанетарность аффинанта, следовательно, и на биоспецифическое сродство к белку, Пространственная вставка обеспечивает наиболее благоприятные гидрофильные параметры, что также снижает неспецифическое связывание и способствует расположению афс1)инанта в среде,

Пример 1. Способ получения биоспецифического сорбента.

Сефарозу 4В (100 мл) промывают на фильтре 1 л дистиллированной

ВОДЫ, переносят s круглодонную колбу, содержашлто 80 мл IN NaOH, и прибавляют 10 ьш эпихлоргидрина, После двухчасового перемешивания при 30-40 С гель тщательно проь-гывают на фильтре дистиллированной водой и инкубир пот 2 ч с раствором 12 г гексаметилендиамина в 100 мл IN NaOn. Образовавшутося аминоалкилсефарозу промывают дистиллированной водой до отрицательной инподринной peaKijjiii про чывнь х вод. К 10 мл полученного водного геля амииоалкилсефарозы прибавляют при перемешивании в течение 1-1,5 ч 180-190 мл диоксана, избыток растворителя удаляют, доводя объем до 10 мл. Раствор 0,425 г (0,98 толь)

(11/35 1 7 ос )11 ,1 7-дигидрокси-3 ,20-диоксопрегн-4-ен-2 1 уксусной кислоты и 0,204 .г

(0,99 ммоль) дициклогенсилкарбодиимида в 15 мл диоксана перемеш вают 2-24 ч при комнатной температуре, осадок отфильтровывают, фильтрат прибавляют к пол енной воднодиоксановой суспензии ашаноалкилсефарозьь Смесь упаривают при пониженном дайлении и температ фе не Bbmie 40 С до объема 10-15 мл.

После перемешивания в течение 18-24 ч гель отфильтровывают, промнвактт на ф1-1льтре 3x15 мл дноксана, содержащего 5% воды, прибавляют 10 мл диоксана, содержащего 5% воды, и зйтем при перемешивании в течение 1-1,5 ч прибавляют 180-190 мл воды. Полученный водньй гель отфильтровь вают, промывают на фильтре последовательно 200-300 мл 1-2%-ным водным раствором NaHCOj и 400-500 М.Л дисти.г лированной воды, 5 Цель изобретения достигается производным сефарозы 4В с аффинантом -(11/0 , 17лО-1 1 , 17-дигидрокси-3 ,20-диоксопрегн-А-ен-21-ил тяо уксусной кисдоты общей формуilpil ИеСОХОДЛМОСТИ MaTiinilV -liDiOlO (гнвесчи R CjaH/UMTirbiii O:ibpii rpnsv iTiCj c пригс ;чл) либс Hoiioc 5C;i vTueMHO гергд тrгlI lЛьзorinIll;f, lit-прореа1 1ронав11 3Н1 i м 1 /A , i 7 л

- , I /-ЛИГЦ-ДрОКСИ-) , 2fb-7;;iOKCCi-:i ei;--t-4 };-2 1 -HJl THol уксусную (

М1;кпо исиользокГать (i Оо;; ;К:;С.:ПГН1 С.Л:,1ОЙ (1ЧИСГК1;.

К1лучеииая тлким обрачпм Опаснотипическая матрггца СПЛР;;/; 3, i8 : (7 ,0;. Ч ,3 , : ,v 1-1 , 7-лигидрокси--J , 20-лиоксп;-рег1---С11--2 1 -пл TiUily KrycHoi: клс,;о1 ь: :а , M:i уплотненного сорбента и iivcfrT c кocгь 32, от максдмял;..но BO3N;oaoioii емкости мс иисЬинироитп ой сефарозы.

I р i р 2 . Выделение транскорт гна с TioMiinbi-j предла аеMfi; : млтриды.

К 200 и сыворотки ретроиладснTapHoi-i крови, не co/iep/Kaueii энлогенннх стор(1идов добавляю-г 10 м.д аффкмной матррпг.ы с коннелтр/щмс:; 1тмкобилизовапиого кортизода JjOS лкг Д-ш уплотпениоД1 1ч-лР „ дтя

yj ajfOllHH Г НДОГСН П11Х СГерОИДС:В к С1)НСФО1 f4t; iipHoaiijiHWT - г аг;ти ; 13(, HOIO УГДН , ТНКубИруЮТ 30 М1-ГН HIT:З/У, а затем уголь отд лтяют донт;)фуг(роваи1гем (lOOOCi я,, IS ьпдО Суспензию аффинного copbeirra с сд-,1вороткой кропи перс {е пивают Ь д при ;(, Гупорнатянт сдивают , а aibbniiный сорбент п 1омьд ают на Фи.:;ьт1-);,.ОС1)- ЩСОКН1СН„)ЛНСН.СИ(ОН)СН,ОР

со

Ц г-.

х11-

X

..,,д

. вставки между аффинантом и носите- лем, конформационные, объемные и стерические параметры пространственной вставки, биохимические,. хи;.шческие и т.п.) является из пpимeняюuц xcя в настоящее время 55

для выделения транспортньпс белков крови.

3 ходе проведенных испытаний оиределение биохимической (фермен , о 1 у 1 j;i:4--:;(M Oj,:;;: ро.; (пП ,. coдcp;l al.;l о ; : :од: i , д; : ар,- ;, ;

Il.A ,,,„; ), iii.,-:r-..а:Ьфиипы11 СОрбсп аорс юсят : -о ,, - ... -;

ovipojjc ;,рЧ , . о ,1 , о

X:-u2i ,, 1 п Д:Д 372. Тра:д:кор: ;: о,;:к)1ту:лт ттим ;:о ткь.лДо:)-,:-; ко- - -;;зода дри , Ьси; - ;з к: .: rbtun: iioC- содержится ..:1,.-и. I :-:а сдЗ.иего -л кг.-; ;;ро--: длхзя аде-1ОГ тоа 1СгД) ;;oi та : ;,.. т-гепсн-1 дз зсдса;: ;; TpaTCKijpTiC.a r;p;i указ.зснпд сдд-тдо;1 ечи д-: сдаорот:Д1 ::ровд ; иг-1Моои П зона Д о:д гс-рспцз (ч/стя оЗл.

; р 1 ; i. р .; , Jipi; дрслдд (

смосдецисЬпчс-скои хроматогдтаф , с пспол1дюнадие а1() д 1|доротки дс ;орскод , л о; .,рой содержание: ; раискорти а з 2--3 раза нижел дом и ретропладентарнод, rICJ; дc;;o 50 Д аффин з):: здоа а , Холи-;естьо (- oiiero Г; д , содержание rpajCKд:1 аг; а 28/, с:с-дс1;ь из 3;jе:чении иг- сынопотк;-; азо-Hoj-i хромате- :1;1ф;1и )ги---;ь; птд

Изучедне химической и биохи :ической устойаиности дредла1ае -т го соед.идения иронод, д срапиедии cc

и началом инкубащ и не превышает 6 ч. При испытаниях используются сыворотки как ретроплаи.ентарной, так и донорской трови. В качестве -гативной) ус roP4 ifiCC;ai преддаг емой и тадод И)й афгринных матрии. с т в л я е т с я г: ар ал л ел ь н ой инк у б а ци е и последних в сыворотке крови человека, ;.1дя сохранения высокой ферментативной (эстеразной) активности сывороток в работе используют свежую сыворотку крови. Интервал между моментом получения крови от донора метода, позволяющего количественно оценить стабильность аффинного сорбента, используется метод радиацион ного контроля. Для контроля концентрации аффинанта на носителе при синтезе матриц к исходному кортизолу добавляется (1,2,6.7 -Н)-кортизол. Удельные.радиоактивности эталонной матрицы 485920 имп./мин, мг .(175900 имп./мин, мкмоль), с предлагаемойматрицы 671000 мк/мин мг (747900 имп./мин, мкмоль). В типичном эксперименте к апикво там (2 мл уплотненного геля) каждого аффинного сорбента добавляют по 20 мл сыворотки крови человека и инкубируют в течение определенного (табл. 1) промежутка -времени при определенной температуре при непрерывном перемешивании. Затем суспензию центрифугируют (6000 g, 3 мин) и удаляют надосадочную жидкость . Аффинные сорбенты последовательно промывают (2у20 мп) стандарт ным буфером (0,05 М трис-НС1. рН 7,6), содержапр м 0,2 моль NaCi, 80%-ным Этанолом ( мл). Промытые аффинные матрицы переносят в мерные пробирки и приготавливают из них 20%-ную суспензию в стандарт ном буфере. Отбирают пробы полученных суспензий (0,2 мл) и помещают и в сцинциляционные флаконы для определения радиоактивности, измерение которой осущр.ствляют на жидкостносцинциляционном счетчике Марк 111 (Тракор Европа, Голландия), Оставшиеся 20% суспензии аффинных матриц центрифугируют (6000 g, 3 мин), супёрнанты отбрасывают,.а оставшееся количество аффинных сорбентов подвергают повторному воздействию сывороточных эстераз на матрицы. Полученные результаты, сыворотки видов крови, численные значения времени и инкубирования сведены в табл. 1. Исследование химической стабильности осзга1ествляется параллельно на промежуточных 21-гемисукцинате кортизола (эталон) и {(11/5 , 17oi ) -11 ,1 7-дигидро-З,20-дйоксопрегн-4- ен-21-ил} тио уксусной кислоте экспозицией последних в водно-спиртовых средах в интервале-рН 1-10 и слежением за протекающими процессами при помощи тех с использова158нием стандартных веществ и по данным ИК-спектрометрии о конечных продуктах. При тонкослойной хроматографии в качестве носителей используются силикагель Вёльм нейтральный, окись алюминия Вёльм . нейтральная, а также стандартные пластинки Silufol UV-258. -В качестве элюентов используются этилацетат, этилацетат:спирт - 9:1, хлороформ:метанол:вода - 188:12,1. Проявление УФ, Л. , термическая обработка (250-300°С, 10-20 мин), Данные ИК-спектрометрии получены на приборе UR-20.. В прессовках КВг и в растворах в хлороформе. Кроме того, физико-химические данные конечных продуктов сравниваются с физико-химическими константами стандартных веществ, Вьщеление конечных продуктов осуществляется общеупотребимыми методами. Это обусловлено тем, что кислотно-основная стабильность сефароз достаточно хорошо исследована и подобная методика прзволяет непосредственно следить за превращением аффинантов как с количественной, так и с качественной точек зрения, .. Полученные результаты, количественные значения рН, времени и температ фы экспозиции, концентрации растрастврров и количества использованных веществ сведены в-табл. 2. Таким образом, на основании полученных результатов в экспериментах с максимальным приближением к практическим условиям использования аффинных матриц и в широком интервале теоретически возможных условий среды установлено, что аффин- ная матрица на основе сефарозы 4В с аф(1)инантом-(11 /3 )-11,17-дигидрокси-3,20-диоксопрегн-А-ен-21-и.лJтиo} уксусной кислоты иммобилизованным последовательным построением пространственной вставки эпихлоргидрином и гексаметилендиамином практически не подвержена ферментативному (зстеразному) разрушению в процессе эксплуатации. Кроме того, ферментативная устойчивость предлагаемой матрицы на по рядок вьшге по сравнению с эталонной. Так, убыль аффинанта.эталонной матрицы после 5 экспозиций составляет 72% или в среднем 22,38% на экспозицию, в то время 9 как убыль аффинанта предлагаемой матрицы составляет в тех же условиях лишь 5,65% или в среднем 1,13% на экспозицию. Следовательно, при -, . использовании предлагаемой матрицы отпадает необходимость дезактива2,43

Исходное состояние

Ретропладентарная

дпирт:Н,0 - 10:5

(15 мл)

iCOj (0,00025 м34,6 мг)

рН 9-10, t комн.

СпиртгН О - 7,5:7,5

(15 мл)

КНСОз (0,0003 м30,0 мг)

Таблица 1

3,08 О

100

100

Таблица 2

о

100

О

о

100

50

о 100 00

о

100

О 30 100 16281510 ции сывороточных эстераз. Кроме того, представленные результаты (табл. 1) показывают, что эталоннал матрица может быть использована не более 3-5 раз, а предлагаемая - до 80 раз.

рН 9, t комн.

СпиртгНгО - 5:10 (1.5 мл)

N3-2.003.10 (0,ОООЗм-85,8 мг)

рН 8-9, t комн.

CtrapT:H O-9:1

(10 мл) (0,5 мл

рН 3-4, t комн.)

Спирт:Н2 0 - 9:1

(10 мл) HCI до

рН 1, t квмн. .

100

100