Способ получения биоспецифического сорбента для аффинной хроматографии Советский патент 1987 года по МПК C07J31/00 C07J41/00 

1351939 2

Изобретение относится к органичес- ния сорбента для аффинной хроматогра- кой химии, а именно к способу получе- фии формулы

НО

SCH2CO H(CH2)6lSlHCH2CH(,OH |CH20- R

о --он

де К - остаток сефарозы 4В, оторый используется для выделения елков из биологических жидкостей тканей и, в частности, транскорти- на сыворотки крови.

Целью изобретения является упроение процесса получения биоспецифи- еского сорбента.

Поставленная цель достигается путем использования в качестве аффинирующего агента биоспецифического сорбента для аффинной хроматографии И гидроксисукцинимидного эфира {lip, 1 7 oi. )-1 1,17-дигйдрокси 3,20-диоксопрегн-4-ен-21-ил тио уксусной кислоты.

Дпя осуществления постадийного радиационного контроля при синтезе и особенно впоследствии при использовании биоспецифического сорбента в синтезе сорбента используется радиоактивномеченный N-гидрокси-сук- цинимидный эфир (1,2,6,7 - Н)корти- зол-21тил-21-тио уксусной кислоты.

Пример 1. К 100 мл суспен- зии, содержащей 75 мл уплотненного геля 2-гидрокси-Э(6-аминогексил-)- аминопропилсефарозы-4В, содержащего 27 мкмоль/мл концевых аминогрупп, прибавляют при.перемешивании в течение 30-45 мин 200 мл спирта, избыток растворителя удаляют, доведя объем до 90-100 мл. К полученной таким образом водно-спиртовой (60%) суспензии аминоалкилсефарозы прибавляют 3,24 г (6,08 Ммоль) Н-гидроксисукци- нимидного эфира (1,2,6,7 н)кортизол- 21-ил-21-тио уксусной кислоты в смеси 30 мл спирта и 10 мл ацетона и оставляют реакционную смесь при 15 - 20°С. За ходом конъюгирования следят радиометрически по убьши радиоактивности в реакционном супернатанте. Согласно данным радиометрии конъюгиро- вание завершается за 8-12 ч и последующее экспонирование не изменяет радиоактивности реактивности реакционного супернатанта. Через 20 ч гель

тфильтровывают, промывают на фильте спиртом (10x50 мл), 80%-ным спиром (3x50 мл), 50%-ным спиртом (3x50 мл), 20%-ным спиртом (3x50 мл), водой дистиллированной до 5000 мп. олученный таким образом водный гель биоспецифического сорбента при необходимости можно перевести в стандарт- ный буфер или сразу после приготовления, или неп осредственно перед использованием. Согласно данным радиационного контроля остаточная радиоактивность супернатанта составила 75,5%, а радиоактивность геля 24,5% радиоактивности исходного эфира. Таким образом, полученная биоспецифи- ческая матрица содержит 8,64 мг (19,87 мкмоль) (.11 , 17об)-11,17- дигидрокси-3, 20-диоксопрегн-4-ен- 21-ил тир уксусной кислоты на 1 мл уплотненного геля сорбента и. имеет емкость 73,6% от максимально возможной емкости исходной аминоалкипсефа- розы.

Из промывных жидкостей возвращено 2,2 г (68% от введенного в конъюгиро- Ba,}iHe) N-гидроксисукцинимидного эфира (1 ,2,6,7 -Н)кортизсл-21-ип-21-тио уксусной кислоты.

Пример 2. К 100 мл суспен- зии, содержащей 75 мл уплотненного геля, указанной в примере 1 аминоалкилсефарозы, содержащего 27 мкмоль/мп .концевых аминогрупп, г.рибавляют при перемешивании в течень е 1 ч 200 мл ацетона, дают отстоять.ся, отделяют 200 мл супернатанта,а с остатком операцию повторяют. К полученной таким образом водно-ацетоновой (85-95%) суспензии амнноалкипсефарозы прибавляют 1,62 г (3,04 Ммоль) N-гидрокси- сукцинимидного эфира (,2,6,7- Н) кортизол-21-ил-21-ти(з уксусной кисло- ты в 30 мл ацетона и оставляют реакционную смесь при 15-20°С. Осуществляя все последующие, операции аналогично примеру 1, получают биоспецифи- ческую матрицу, содернащую 9,17 мг

(17,2 мкмоль) .( 11 Р) , 17со)-11,17- дигидрокси-3 20-диоксопрегн-4-ен- 21-илЗтио уксусной кислоты на I мл уплотненного геля сорбента и имеющую емкость 63,7% от максимально возможной емкости исходной аминоалкилсефа- розы.

Из промывных жидкостей возвращено 0,86 г (53% от введенного в конъюги- рование N-гидроксисукцинимидного эфира (1,2,6,7- Н)кортизол-21-ил-21- тио уксусной кислоты.

Способ получения биоспецифическс го сорбента значительно упрощает технологическую схему получения последнего, позволяет при необходимости гибко перестраивать производственный процесс и осуществлять наработку в необходимых объектах.

Формула изобретения,

Способ получения биоспедифическо- го сорбента для аффинной хроматографии общей формулы

г5СН2Са Н(СН2)бЫНСН СН(ОН)СН20-1 0

--он

где R - остаток сефарозы-4В, путем взаимодействия 2-гидрокси-3(6- aминoгeкcил )-аминощ)опилсефарозы-4В с производным ( 11 , 17 л )-П , 1 7- дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21- ил тио уксусной кислоты в смеси орга- нического растворителя с водой, о т- личающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качест ве производного (1 1 р , 1 7 Л )-11 , 17Редактор э.Слиган Заказ 5538/21

Составитель И. Федосеева

Техред А.Кравчук Корректор Л.Патай

Тираж 348Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035., Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-2I- шт THoJ уксусной кислоты используют N-гидроксисукцинимидный эфир в 1,53-кратном избытке по отношению к количеству концевых аминогрупп 2-гид- рокси-3(6-айиногексил)-аминопропил- сефарозы-4В и процесс проводят в среде водного этанола или водного ацетока при содержании воды 5-40 мас.%.

Изобретение касается биоспецифических сорбентов для аффинной хроматографии, в частности сорбента для аффинной хроматографии (САХ)формулы НО -SCH2CONH(CH2)6NHCH CH(OH)CH20-R -ОН где Е сефароза-4В, который используют для выделения белков из биологических жидкостей и тканей, в частности транскортина сыворотки крови. Для упрощения процесса получения САХ синтез ведут из 2-гидрокси-З(6-акиногексш1)-аминопро- пилсефароны-4В и Ы-гидроксисукциннмид- ного эфира ( 1 1 |J , 1 7 oi )-11,17-дигид- рокси-3,20-диоксо-прегн- 4-ен-21-Ш1 - тиоЗ уксусной кислоты, взятого в 1,5- 3-кратном избытке по отношению к количеству концевых аминогрупп амино- апксилсефарозы в среде водного этанола или водного ацетона при содержании воды 5-40 мас.%. Способ упрощает технологию получения САХ за счет использования более дешевых и менее токсичных растворителей, а также большей устойчивостью промежуточного N- гидроксисукцинимидного эфира. (Л со ел со со со