Способ выделения белка Советский патент 1986 года по МПК C07K1/22 G01N33/50 

00

ю

00

Изобретение относится к области биохимии и медицины, конкретно к выделению белка, связывающего тироксин который может быть использован в качестве ингредиента радиодиагнос-, тических наборов для определения , тироксина.

Известен способ выделения белка, связывакщего тироксин, заключанщийся в обработке разбавленной водой в соотношении 2:1 сыворотки ретроплацентарной крови гидроксиапатитом, центрифугировании и аффинной хроматографии супернатанта на сорбенте, представляющем собой сефарозу, активированную 1,4-биc(2,3-эпoкcипpoпoкcи)бyтaнoм (эпоксиактивированная сефароза) с присоединенным лигандом - тироксином с последующей элюцией 2niM 8-анилинонафталиносульфокислотой (ANS). Из литра сыворотки получено 13-15 мг белка, связывающего тироксин, что составляет 22 l .

Недостатками способа являются низкий вьпсод белка, связывающего тироксин, и необходимость обработки сыворотки гидроксиапатитом, что усложняет процедуру выделения.

Целью изобретения является повышение выхода белка, связывающего тироксин, а также упрощение процесса.

Поставленная цель достигается тем что в качестве эпоксисефарозной матрицы используют сефарозу, активированную эпихлоргидрином, а элюцию белка с сорбента осуществляют щелочью при рН 9,3-12.

Используемый сорбент вследствие своей структуры обеспечивает более селективное извлечение выделяемого белка и, как следствие, более высокий выход.

В сорбенте, используемом в способе - прототипе, более длинная по сравнению с предложенным сорбентом гидрофобная ножка, соединяющая лиганд с матрицей - остаток 1,4-бис(2,3-эпоксипропокси)бутана. Это оказывает существенное влияние на процесс сорбции. За счет гидрофобных взаимодействий возможна сорбция других белков, которые загрязняют аффинный элюат, что препятствует сорбции тироксин-связывающего белка и снижает его выходv

Соотношение объемов сыворотки крови и аффинного сорбента при опреде171

ленной концентрации конъюгированного

тироксина подбирается эмпирически.

Оптимальная концентрация иммобилизованного тироксина в полученной суспензии 5-10 - 1-10 мол/л. Влияние объема аффинного сорбента при постоянном объеме сьторотки крови (1л) на выход целевого продукта приведено в таблице.; .

Элюция целевого продукта щелочью по сравнению с элюцией В-анилинонафталиносульфокислотой позволяет получить свободный от лиганда белок,

тогда как при элюции 8-анилинонафталиносульфокислотой необходима очистка целевого продукта от элюента.

Указанный интервал значений рН при элюции определяется, с одной стороны, точкой ионизации гидроксильной группы тироксина, а с другой - возможностью инактивации белка в сильнощелочной среде. .

Пример 1. Синтез аффинного сорбента.

100 мл сефарозы 4В (Pharmacia Fine chemicals, Швеция) промьшают на фильтре 1 л 0,5 М NaCl и 1 л воды. К влажному гелю прибавляют 80 мл 1 М NaOH.H 10 мл эпихлрргидрина. Смесь перемешивают 2.ч при температуре 37 С. Избыток реагентов отмывают последовательно водой (4 л) и 0,1 М NaHCOj, рН 8,6 (1 л). В результате реакции получают матрицу с 30 мкмол эпоксигрупп на 1 мл геля. Затем 200 мг тироксина растворяют в 10 мл 1 М NaOH, перемешивают 4 ч при комнатной температуре и оставляют на ночь при 2-8С. По окончании реакции аффинный сорбент промывают 0,1М NaHCOj рН 8,6 (4 л). Полученный сорбент, содержащий2,4 мкмол иммобилизованного тироксина 1 мл геля, разбавляют сефарозой 4В до концентрации тироксина 1 мкмол на 1 мл геля . Концентрацию иммобилизованного тироксина определяют согласно 2,

П р и М. е р - 2. Получение белка, связьшающего тироксин.

1 л сыворотки ретроплацентарной крови перемешивают в течение ночи при температуре 4 С со 100 мл аффинного сорбента, содержащего 1 мкмо конъюгированного ти11 оксина на 1 мл геля, что создает концентрацию тироксина во всем объеме суспензии 110 иол. Аффинный сорбент отделяют путем фи,цьтрования суспензии на по3ристом фильтре и промывают 1,5 л 0,1 М NaHCOj, рН 9,0. Гель перенося на колонку с пористым стеклянным фильтром и продолжают отмывку до получения элюата с постоянной оптической плотностью при 280 нм.Элюцию целевого продукта осуществляют при (сомнатной температуре 0,001 М NaOH, ;рН 11,0. Скорость элюции 3 мл/мин. Количество белка, связывающего тиро ксин, в элюате составляет 45 мг иди 90%, Выход целевого продукта в зави, симости от количества .аффинного сорбента (на 1 л сыворотки) 17 Продолжение таблицы Технико-экономическая .эффективность изобретения состоит в повышении выхода белка, связываняцего тироксин. Способ гарантирует одностадийное, практически количественное, выделение из сыворотки ретроплацентарной крови белка, связьгоающего тироксин. Воспроизводимость способа, практически количественный выход белка, связывающего тироксин, низкая стоимость и доступность сырья делает возможным наладить опытно-промышленный выпуск диагностических наборов для определения тироксина, основным компонентом которых является белок, связывающий тироксин.

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ БЕЛКА, СВЯЗЫВАЮЩЕГО ТИРОКСИН, из сыворотки ретроплацентарной крови путем аффинной хроматографии с использованием в качестве сорбента эпоксисефарозной матрицы с присоединенным лигандом - тироксином, о т л и ч а ющ и и с я тем, что, с целью повышения выхода выделяемого белка и упрощения процесса, в качестве эпоксисефароз юй матрицы используют сефарозу, активированную эпихлоргидрином, а элюцию белка с сорбента осуществляют щелочью при рН 9,3-12. «