Непланоцин @ или его производные в качестве промежуточных продуктов в синтезе непланоцина @ Советский патент 1985 года по МПК C07D235/00 

Од

ел

Од 00

о Изобретение относится к новым не планоцинам D и его производным обще формулы rt .,x V КОНгС RO OR где , SH, ЗСНз; или которые используются в качестве про межуточных продуктов в синтезе непланоцина А. Непланоцин А оказывает подавляющ действие на патогенные микроорганиз мы растений, а также обладает проти воопухолевой активностью. Его получают путем инокулирования штамма ви да Ampullariella А.11079 FERM-P № 4494 в питательной среде.. Выделение антибиотика осуществляется путе поглощения адсорбентами с последующим элюированием водноорганическими растворами lj . Недостатками способа получения н планоцина А является его низкий выход, трудоемкость процесса, громозд кость аппаратурного оформления производства. Целью изобретения является химический синтез непланоцина А из непл - ноцина D и его производных, который получают в качестве побочного продукта при микробиологическом производстве непланоцина А. Непланоцин D получают путем иног кулирования штамма вида Ampullariel la А11079 FERM-P № 4494 в питательной среде. Микроорганизмы могут выращиваться различными способами в искусственной или естественной среде, жидкой или твердой культуре. При промышленном получении предпочтительна жидкая среда. Для составления среды могут применяться усваиваемые источ Н.ИКИ углерода и азота, неорганические соли и другие вещества. Эта среда применяется для микроорганизмов, производящих антибиотики-непланоцины. В качестве источника углерода может применяться глюкоза, сахароза, глицерин, растворимый крахмал и тому подобные материалы. В качестве источников усваиваемого азота.могут применяться пентон, порошок соевых бобов, экстракт пшеницы, мясной экстракт, рисовые отруб -., гидролизат казеина, нитрат, аммониевая соль и т.п. Могут т.акже применяться неорганические соли, такие как хлористый натрий, фосфаты кальция, 1 агния, железа III или марганца. Может добавляться противопенное вещество, такое как силиконовое или, соевое масло. В случае жидкой культуры предпочтительно применять погруженную аэрируемую культуру. В этом случае выращивание осуществляют при оптимальной для микроорганизмов температуре, предпочтительно при 25-30 С. Продолжительность выращивания зависит от применяемых условий и обычно равна 2-4 дням. рН среды при выращивании регулируется.от нейтральной до слегка кислой. Такая культурная среда содержитантибиотики-непланоцины. Выделение антибиотиков-непланоцинов может быть осуществлено стандартным вьзделением или отделением (способами,применяемыми для вьщеления продуктов обмена микроорганизмов). Так как непланоцины представляют собой слабые основания, они могут быть вьщелены путем поглощения приемлемыми адсорбентами с последующим элюирова-. нием подходящим растворителем, В качестве адсорбентов могут применяться активированный уголь, катионообменные смолы, активированный глинозем или силикагель. Элюирующие растворители выбирают в зависимости . от применяемого адсорбента, например, .это могут быть смешивающиеся с водой органические растворители, такие как водный метанол, водный ацетон или водный.диоксан. или растворы солей, или кислот, щелочные растворы. Кроме того, непланоцины могут выделяться и очищаться как вещества слабощелочной природы. Например, антибиотики поглощают катионообменной смолой, такой как Амберлит 1РС-50 (т.орговая марка продукта фирмы 3 Ром и Хаас, США) или Доувек 50 (торговая марка продукта фирмы Доу Кемикл, США) и элюируют прием лемым кисловым, щелочнь1м или солевым раствором. Для вьщеления, элюирования и очи стки антибиотиков предпочтительно применять сочетание адсорбента и ионообменной смолы . Например, фильт рат культуры загружаиот в катионообменную смолу Амберлит IR-120 (торго вая марка) для поглощения антибиотика, элюируют щелочным раствором, например 3,7 к. водным раствором ам миака, с получением активной Фракции, и после регулирования рН до не тральной или слабощелочной среды антибиотики адсорбируют активирован ным углем с последующим элюированием 70%-ным метанолом. Элюент адсорбируют анионообменной смолой Амберлит IRA-410 (торговая марка) и внов элюируют водой для сбора активных фракций. Объединенные фракции концентрируют, получая сырой продукт, который затем подвергают очистке на силикагеле. Дальнейшую очистку осутествляют перекристаллизацией. Чист та соединения может быть определена по точке плавления или по одному пятну на бумажной хроматографии, 804 тонкослойной хроматографии и бумажном электрофорезе при 2630 А УФ-света, Для этого три гидроксильные группы в циклопентеновом кольце непланоцина D защищают путем -взаимодействия с бензоилхлоридом. Гидроксильную группу в адениновой структуре непланоцина D заменяют маркапто-группой, ля чего осуществляют реакцию с пяти- сернистым фосфором, затем удаляют заитную группу для гидроксильной группы j . результате чего получают производное непланоцина D (ГИ) . Метилированием его метилйодидом получают производное непланоцина D (IV), которое обрабатывают метанольным аммиаком, в результате чего получают непланоцин А. Кроме того, три гидроксильных группы в циклопентеновом кольце непланоцина D защищают путем ацетилирования. Этого достигают взаимодействием с уксусным ангидридом. Затем указайное соединение превращают в производное непланоцина D (VI) путем взаимодействия с хлористым тионилом. Производное непланоцина D (VI)мoжeт превращаться в непланоцин А через производное непланоцина D путем обработки метанольным раствором аммиака. Описанные реакции могут быть проиллюстрированы следующей схемой:

бенуфпи(лорид

ОН

й

BzOCH,

НО он

Непланоцин J/

5Н

rt:

BzOCHoxv

ОВг OBz

П

OBzOBz

J

I

йС

N

НОСЯ,

Я

ОН он

ш

ЗСНз

Метанольныа СНзО I Н 7 амниан

НОСИ,

он он

Произбодное непланоцина V (Ш)

Непланоцин А

Иепланоцин } if

уксусный ангидрид

$001

ЛсОСН2.,.гх

Ас о О Ас

Непланоцин А

Пример 1. В 500-миллилитровую колбу загружают 1.00 мл водной среды (рН 6,5), содержащей 2% глюкозы, 2% крахмала, 1% дрожжевого экстракта, 1% гидролизата казеина и 0,2% карбоната кальция. Содержимое колбы стерилизуют втечение 15 мин при 120°G, В две колбы этой среды высевают одну петлю со скошенной культурой вида Ampullariel-la А 11079 FERM-P № 4494 и встряхивают при . Через четыре дня культуральную среду переносят в 20 л такой же, как указанная стерилизованной среды, которая находится в 30-литровом бродильном чане, и выращивают при при перемешивании с 300 об/мин и аэрировании 20 л/мин

;В течение 48 ч.

Выращенную таким путем среду переводят в 200 л водной среды (рН 6,5 содержащей 4% глюкозы, 1% порошка соевых бобов, 0,4% мясного экс, тракта, 0,4% пептона, 0,1% дрожжевого экстракта, 0,25% хлористого натрия и 0,1% карбоната кальция, и выращивают при 30 С при перемешивании с 180 об/мин и аэрировании

АООСН.

Ас о О Ас

VI

Произ6;0дное непланоцина }

rJO л/мин в течение 40 ч. Полученный бульон ( 200 л) фильтруют, и грибницу промывают водой. Фильтрат и промывочную воду объединяют, в результате чего получают примерно 140 л прозрачного фильтрата.

К фильтрату добавляют 3,6 кг порошка активированного угля. После перемешивания в течение 40 мин активированный уголь отфильтровывают и тщательно промывают водой. Элюирование осуществляют 70%-ным метанольным раствором. 40 л элюата сушат в вакууме,, получая 80 г сырого порошка, содержащего непланоцин D.

В колонку, заполненную 6 л силикагеля со смесью растворителей Ц-пропанол:концентрированный водный раствор аммиака:вода (10:1:1), вводят 80 г сырого порошка и затем элюируют его той же смесью растворителей. Фракционируют каждые 600 г элюата . Непланоцин D найден во фракциях №,№ 20-37. Указанные активные фракции собирают, концентрируют в вакууме до 30 мл и выдерживают при охлаждении. Фильтрованием отделяют осадок, в результате чего получают 7 А60 мг сырого кристаллического непланоцина D, 460 г сырых кристаллов растворя ют в 3 л горячей воды и вводят в к лонку с Сефадексом G-15 (1850 мл, . заполненную водой), затем элюируют водой. Фракционируют каждые 100 мл элюата, собирают фракции элюата №,№-15-16 (200 мл) и концентрируют при пониженном давлении до 20 мл. Полученны11 концентрат вьщерживают при комнатной температуре. Получают 314 мг вьщелившегося в оса док непланоцина D в виде белых крис таллов. Непланоцин D имеет следующие физико-химические характеристики: элементный анализ,%: С 49,70; Н 4,64; N 21,20; мол. масса (опреде лена из масс-спектрального анализа) :264; т.пл. 236-237°С; удельное вра щение 145 ° (,6% HjO). Спектр ультрафиолетового поглощения. В воде: Л, 2510 А Е,,. .,, В кислой воде: Л 2510 А Е,53. В щелочной воде: 2360 А . Инфракрасный -спектр поглощения (КВг): полосы поглощения при 34203120, 2940-2880, 1680, 1580. 1545. 1510,1440,1390,1305,1210,1110,1075 1040, 1000, 990, 975, .900, 845, 780 см Растворим в воде, диметилсульфок сиде, диметилформамиде, уксусной кислоте и пиридине. Нерастворим в этиловом эфире уксусной кислоты, хлороформе, бензоле и гексане. Цветная реакция. Положительная: обесцвечивает перманганат калия и окисляет перйодат; отрицательная: нингидрин, Фалинг и хлорид железа (III). Цвет: белые игольчатые кристаллы RI величина (силикагель, фирмы Токио Касей, силикагель (f):Н -бу танол:уксусная кислота:вода (6:1:1) R,0,27;И -бутанол:конц.нашатьфный спирт:вода (10:0,5:2) ,07; Н-пропанол:конц.нашатырньй спирт: вода (10:1:1) R.0,18; ацетонгвода (10:1) ,33. Пример 2. 376 мг непланоци на D, растворенного в 10 мл безвод80ного пиридина, тщательно перемешивают при 55 С. По каплям к раствору добавляют 0,8 мл хлористого бензоила и перемешивают в течение 2 ч при 60-65°С. Затем раствор выдерживают при 40-45°С, в течение 8 ч при комнатной температуре. При перемешивании добавляют 10 мл воды и спустя 25 мин сушат при пониженном давлении в испарителе. Высушенньш материал растворяют в 30 мл хлороформа, промывают трижды 10 мл однонормальной соляной кислоты и дважды однонормальным раствором бикарбоната натрия после чего дважды промывают 20 мл воды. Хлороформный слой обезвоживают безводным сульфатом магния и концентрируют до получения 747 мг соединения формулы (1)бледно-розовой окраски (выход 91%). Соединение формуль; (I) имеет следующие физико-химические характеристики:) (, 6, метанол); молекулярная формула -Зг Ч 1 7 . масса 576 (массспектр); т. пл. 116-177 С. УФ-спектр поглощения:А/иаге 232 А .704. К.-величина (хлороформ:метанол 10:1) ,53. Тщательно перемешивают 735 мг соединения формулы (I), приготовленного вьше, и 1,0736 г пентасульфида фосфора, растворенного в 19 мл пиридина. К смеси по каплям добавляют 0,19 мл воды. После кипячения с обратным холодильником в течение 4 v при перемешивании реакционную смесь охлаждают и концентрируют в вакууме/ В результате получают коричневый маслянистьп1 продукт. Маслянистый продукт вливают в кипящую воду при перемешивании и дополнительно перемешивают в течение 30 мин, получая желтоватый материал. Его фильтруют для отделения осадка, промывают смесью этилового спирта и серного эфира (1:1), дополнительно промывают серным эфиром и сушат, в результате чего получают 561 мг соединения формулы (II). Выход 74,3%. Соединение формулы II имеет следующие физико-химические характеристики:И -286,9 (,6, CHCl,); молекулярная формула С 2 Н 2f S ОА S; мол. масса 592; т. пл. 235-239 С (разложение пены). УФ-спектр (в метаноле): 2320 Д Е,858,5; 3230 А 327,5. Rj-величина (хлороформгметанол 10:1) ,82. Пример 3. В 31 мл безводного метилового спирта растворяют 525 мг соединения формулы (II), полученного в примере 2. Добавляют 0,62 мл свежеприготовленного двухнормального раствора метилата натри в метаноле и кипятят при перемешивании в течение 2 ч с обратным холо .дильником, в результате чего удаляют бензоильные группы. После отгонки метилового спирта добавляют примерно 50 мл и регу лируют рН до 7,5 добавлением уксусной кислоты. Раствор дважды экстрагируют 20 мл sTttnoBoro эфира уксусной кислоты и концентрируют водный слой, получая производное непланоцина D формулы (III) в виде игольчатых кристаллов. Осуществляют пере кристаллизацию из горячей воды, пол чая МО мг производного непланоцина D формулы (III). Выход 4,3%. Производное непланоцина D формулы (III) имеет следующие физикохимические свойства: удельное враще ние невозможно измерить из-за изменения величины при измерении. Молек лярная формула С мас са 280 (по масс-спектру); т. пл. 26 262 С (с разложением). УФ-спектр в 2260 Л ( 388,6), 3240 А ( 968,0) . Величина R (пропанол: конц.водный аммиак:вода 10:1:1) ,21. И р и м е р 4. К раствору 37 мГ производного непланоцина D формулы (III), приготовленного по примеру 3 в 0,3 мл 0,4 н. гидроокиси натрия добавляют 0,009 мл метилйодида и встряхивают при комнатной температу ре в течение 10 мин. Затем добавляю 0,05 мл 0,4 н. гидроокиси натрия и дополнительно добавляют 0,009 мл йодистого метила, вновь встряхивают и вьщерживают при комнатной темпера туре. К этому раствору добавляют 10 мл воды, концентрируют в вакууме .до 2 мл и вносят в колонку 1,4x49 с заполненную Сефадексом G-15. Элюиро вание осуществляют водой и фракционируют казкдые 3 г элюата. Собирают фракции №,№ 17-19, концентрируют и охлаждают, получая 35 мг кристаллического производного непланоцина D формулы (IV). Выход 90%. Производное непланоцина D формулы (IV) имеет следующие физикохимические характеристики: «г) 141,7 (,7,вода); молекулярная формула мол. масса 294 (масс.-спектр); т. пл. 177-1J8°C. УФ-спектр в воде: 2220 А (E}J;, 415,8)5 2880 Я (,); 2950 X (,8): 2880 А ( 676,3); 2950 i (Ej,; 670, 7). Величина R (пропанол:конц.водный раствор аммиака:вода 1:1:1) , ,42. Пример 5. Синтез непланоцина А из производного непланоцина D формулы (IV). 50 мг производного непланоцина Р формулы (IV), полученного в соответствии с той же методикой, что опиcdHa в примере 4, растворенного в 1,5 мл метанольного раствора аммиака (, насьпцение), помещают в запаянную трубку и выдерживают при 146-148с в течение 7 ч. После удаления растворителя при пониженном давлении остаток растворяют в 3 мл горячей воды, затем охлаждают, получая 33 мг непланоцина А в виде игольчатых кристаллов. Выход 74%. Пример 6. К 1,14 г непланоцина D в 12 мл безводного пиридина добавляют 1 мл уксусного ангидрида и вьщерживают при комнатной температуре в течение 8ч. Добавляют 30 мл Н-гексана и охлаждают в ледяной воде, получая 1 г кристаллического соединения, формулы (V). 1 г соединения формулы V добавляют к 25 мл раствора 0,8 мл тионилхлорида и 0,4 мл диметилформамида в хлороформе и кипятят с обратным холодильником в течение 3. ч при комнатной температуре. Хлороформ отгоняют при пониженном давлении. Остаток вливают в 100 мл ледяной воды при перемешивании. Осуществляют экстракцию 100 мл хлороформа, промывают бикарбонатом натрия и водой и сушат сульфатом натрия. После сушки в вакууме получают производное непланоцина D формулы (VI). Пример 7. Синтез Непланоцина А из производного непланоцина D формулы (VI). К производному непланоцина D формулы (VI), приготовленному в приn116568012

мере 6 и помещенному в стальную за- Физико-химические характеристики

крытую трубку, добавляют 35 мл насы-идентичны тем, которые отвечают изщенного раствора аммиака n метиловомвестному непланоцину А. спирте и проводят реакшто при ЮО-с Представленный химический синв течение 5 ч. После охлаждения ре- 5тез непланоцина А из непланоцина D

акционную массу сушат в вакууме иосуществляется при более высоких

получают кристаллический поро -концентрациях (химический процесс),

шок , который подвергают хрома-чем при ферментации, что позволяет

тографической очистке на сили-использовать небольшие компактные

кагеле. Получают 286 мг непла- 0реакционные сосуды и простые услоноцина А..ВИЯ проведения, реакционного процесса.

Непланоцин D или его производ.ные общей формулы Л ROHgC. RO OR где . (Л X ОН, SH, или с , в качестве промежуточных продуктов в синтезе непланоцина А.