1
Изобретение относится к области микробиологии и касается синтеза нового антибиотика, способ получения которого в патентной и научно-технической литературе не описан.
Предлагаекий способ получения антибиотика форму.лы
На агаре с овсяными хлопьями Кастера воздушный мицелий дает спороносные ветви, оканчивающиеся плотно свернутыми спиралями из нескольких витков. Споры боль1чей частью некруглые, суставчатой формы. Размер спор 0,6-0,8 мкм. Поверхность спор гладкая. Оболочки спор тонко моргпикистые,
Агар Чапека, Рост слабый. Следы беловатого воздушного мицелия. Спорообразования нет. Растворимый пигмент отсутствует, Субстрактный мицелий от бесцветного до беловатого.
Среда с дрожжевым экстрактом. Рост хороший. Воздушный мицелий беловатый,, от светло- до темно-коричневого в зонах спорообразования.Спорообразование обильное. Растворимый пигмент желтоватый, Субстрактный ми целий желтый. Черноватые гигроскопические поверхности в центральных эонах колоний в
Среда с аспарагином-декстрозой. Рост умеренный. Воздушный мицелий беловатый, от пепельного до светлокоричневого в зонах спорообразования. Спорообразование умеренное. Растворимый пигмент отсутствует. Субстрактный мицелий желтый. Черноватые гигроскопические поверхности в центральных зонах колоний,
Среда с крахмалом. Рост умеренны Воздушный мицелий от беловатогодо желтоватого, от светло- до темнокоричневрго в зонах спорообразовани Спорообразование обильное. Растворимый пигмент отсутствует, Субстрактный мицелий пастельно-желтый, Черноватые гигроскопические поверхности центральных зонах колоний.
Агар Беннета.Рост умеренный. Воздушный мицелий беловатый. Темно-коричневый в зонах спорообразования. Растворимый пигмент желтоватый, Субстрактный мицелий: желтый. Черноватые гигроскопические поверхности в центральных зонах колоний,
Агар картофель-декстроза, Рост хоргаоий. Воздушный мицелий от беловатого до. желтоватого, от пепельного до саетло-коричневого в эонах спорообразования. Спорообразование умеренное. Растворимый пигмент желтоватый, светлый, Субстрактный мицелий желтовато-зеленый. Черноватые гигроскопические поверхности в центральных зонах колоний.
Физиолого-биохимические признаки
Нитраты восстанавливает я нитриты. Желатину разжижает полностью, Меланоидных пигментов не образует. На седьмые сутки молоко пентонизирует полностью.
Переносимость NaC& в культуральной среде 7-10%,
Хорошо усваивает адонитол, d -галактозу, d -фруктозу, d-рафинозу, салицин, d -ксилозу и декстрозу.
Плохо усваивает d-мелезитозу, d -мелибиозу. Не усваивает 6-арабинозу,
Е-инозитол, лактозу, d-маннитап, К-рамнозу, сахарозу и б -трегалозу. Культивирование штамма S-t.ti gToscopicus NRRL 8180 проводят в очень разнообразных средах, содер жащих усваиваемые источники углерода, например, крахмал, сахар, мелассу, глицерин,азота,.например белок, белковый гидролизат, полипептиды, а инскислотыj кукурузный настой,минеральные соли, например соли калия натрия, кальция, сульфаты, Фосфаты, хлориды. Микроэлементы, яапример бор, молибден, медь поступают вмест с другими компонентами среды. Аэрирование проводят поверхностным или глубикмым методом при перемешивании механической мешалкой, иногда с добавлением антивспенивателя например 1% октадеканола в олеомаргарине.
Посевной материал St.ti: groscoptcu5 готовят путем заражения 100-мл порций стерильной среды в 500-мл колбах соскабливанием или с№аванием спор с косого агара культуры. Обычно применяют следующую.среду,вес.%: Соевая мука1,0 Глюкоза2,0
Кукурузный настой 0,5 Карбонат кальция 0,3 ВодаОстальное
Колбы инкубируют при 25 29°Cf предпочтительно при , и интенсивно взбалтывают в течение 48-96 ч
Двумя 100-мл порциями посевного материала засевают 12 л стерильной среды в 20-л бутылях и перемешивают при аэрации и 25-29С, предпочтительно 2,8с, в течение 36-64 ч.
Полученным материалом засевают 300 л той же стерильной среды в ферментере, перемешивают в течение 36-64 ч при 25-29°С, предпочтительно при , и аэрации.
Этот посевной материгш и-спользуют для засевания 4000-л ферментера содержащего 3000 л стерильной среды имеющей следующий состав, вес.%; Кукурузный настой 0,5 Соевая мука1,0
Крахмал кукурузный 4,0 Карбонат кальция 0,1 ВодаОстально
Эту среду Ферментируют 100-200 ч при 27-32с, перемешивании мешалкой и аэрации (0,4-0,8 л воздуха в 1 ми на 1 л cpenji) , Добавляют антивспениватель, например Ходаг FT) 82, в количестве 1,3 ч. на 1000 ч. среды
Полученную массу, содержащую антибиотик BL 508, смешивают с половинным объемом этилацетата и перемешивают 2-3 ч. Добавляют 8% диатомитовой земли, фильтруют на рамном фильтрпре(ссе, фильтровальный жмых промывают в фильтрпрессе этилацетатом, фильтрат и промывки концентрируют до сиропообразного состояния, перемешивают с двойным объемом гептана и оставляют на ночь при Верхний слой декантируют к концентрируют до получения смолистого остатка.
Смолистый остаток обрабатывают 10 л метанола и несколько часов охлаждают сухим льдом, фильтруют через спеченное стекло, покрытое диатомитовой землей, и промывают холодным метанолом, Метанольный раствор концентрируют в вакууме досуха, остаток растворяют в хлористом метилене (40 г/л) и пропускают через колонку, заполненнуюактивированным углем (1 л угля на 50 г загрузки), элюат концентрируют досуха, остаток смешивают с метанолом, охлаждают сухим льдом в течение 15 мин до -10°С, застывшее масло отфильтровывают, фильтрат концентрируют в вакууме досуха и получают масло.
Это масло растворяют в минимальном количестве хлористого метилена, смешивают с силикагелем, упаривают досуха и загружают в колонку с су-, хим силикагелем. Элюкруют сначала 10%-ным, а затем201-ным раствором этилацетата в бензоле, колонке дают стечь, делят ее на 10 равных частей {включая загрузку), образцы насадки отбирают ,05, 0,15, 0,25, и т,д, по длине всей колонки и элюируют подходя1дам объемом смеси этилацетат - хлористый метилен-метанол (3:2:1) . В местах , где полосы антибиотика накладываются, отбор призводят через каждую , Наличие антибиотика устанавливают по данным тех и по обугливанию в присуствии серной кислоты.
Образцы 0,11-0,35 вырезают из колонки и взмучивают в смеси этилсщетат -хлористый метилен-метанол (2:2:1 по объему), фильтруют, промывают смесью растворителей и концентрируют в вакууме досуха. Остато растворяют в трет-бутаноле, фильтруют, лиофилизируют и получают пушистое .твердое вещество.
Нижнюю фазу системы н-гептанэтилацетат-метанол-вода (3000 г 1500: :75:37 по объему) смеихивают с диатомовитовой землей (на 800 г земли 600 мл фазы), загружают в колонну (диаметр 7,5 см) смесь 40 г диатрмитовой зегШей (на 800 г земли 600 мл фазы), загружают в колонк и элюируют верхней фазой указанной системы, отбирая фракции по 25 мл, Наличие антибиотика во фракциях определяют методом тех в системе хлороформ- этилацетат и по обугливанию, Фракции 90-150 объединяют, концентрируют и получают антибиотик BU 508&,
Пример 1, Стерильную среду содержаиую, г:
1,0
Соевая мука
2,0.
Глюкоза
0,5
Кукурузный настой
0,3
Карбонат кальция
До 100 МП
Вода
заражают смытУми или соскобленныг-м с косого агара спорами. St.h jgToscopicue . Применяют .две 500-мл колбы, содержащие по 100 мл указанной среды. Колбы интенсивно взбалтывают 72 ч при 28°С.
0
Полученный материал из 500-мл колбы переводят в бутыль, содержащую 12 л той же среды,и ферментируют 48 ч при и аэрации.
Затем пересевают в ферментер, со5держащий 300 л той же стерильнойсреды, и перемешивают (173 об/мин) при аэрации (1 л воздухана 1 л среды Е 1 NMH) в течение 48 ч при 28°С, поддерживая рН 6,9-7,0,
Пример 2. Среду, содержащую, г:. .
Кукурузный настой 0,5
Соевая мука1,0
Крахмал кукурузный4,0
Карбонат кальция0,1
5
ВодаIДо 100 мл
стерилизуют при 120°С и рН 6,4-6,5 в течение 60 мин. 3000 л среды засевают 300 л материала, полученного в примере 1, ферментируют при 28Q, аэрации (0,6 л воздуха на 1л среды в 1 NIKH) и перемешивании (150 об/мин) в присутствии 4 л ан тивспенивателя в течение 138,5 ч в 4000-л ферментере.
5
Пример 3. 2550 л (рН 7,4) массы после ферментации, полученной, как в примере 2, и 1275 л этилацетата пере /1ешивают 2,5 ч. Добавляют 8% диато итовой земли, фильтруют несколькими порциями на паре рамных фильтрпрессов, Фильтрату (3250 л) дают отстояться и отделяют этиладетатный слой (1000 л) , После фильтрования каждой порции жмых пpo ывaют в фильтрпрессе этилацетатом, Пр.омыв5ки рбъединякгг, дают им отстояться и отделяют этилацета ный слой (535 л) , ЭГИЛацетатные слои концентрируют сначала до 225 л, затем до 20 л,Эти 20 л концентрируют в стеклянном дис0тилляционном аппарате до получения сиропа.
Сироп выддерживают 48 ч при 4 С, перемешивают с двойным объемом гептана и оставляют на ночь при 4С,
5 Верхний слой отделяют декантацией и концентрируют до получения смолистого остатка,
К СМОЛИСТОМУ остатку добавляют 10 л метанола, охлаждают сухим льдом
0 несколько часов, фильтруют через .спеченное стекло, покрытое диатомитовой землей, и холодным метанолом. Объединенные фильтраты и промывки концентрируют досуха в
5 вакууме и получают 1353,6 г остатка.
1353j6 г остатка растворяют в хлористом метиЛене (40 г/л) и пропускают через колонку, заполненную 27,07 зернистого угля (20 х 40 меш) ,, со скоростью 375-400 мл/мин. Элюат концентрируют досуха, остаток, (1053 г) тщательно смешивают с 89 л метанола, охлаждают до-10 С сухим льдом и выдерживают 15 глин при , Застывшее масло отфильтровывают, фильтрат концентрируют досуха и получают 781,4 г масла, 200 г масла растворяют в минимальном котгичестве хлористого метилена, обавляют 300 г. силикагеля, тщательно перемешиведат, упаривают в вакууе досуха и. загружают в пластмассовую КОЛОНКУ; заполненную 4 кг сили кагеля, сверху кл-йдЗ/т немного морского песка для предупреждения наруения слоя во элюирования, люируют 12 л раствора этилацетата в бензоле, колонке дают стечь и элюируют 7р6 л 20%-ного аствора этилацетата в бензоле, От фракции, лают колонке стеч.ь, и продувают азотом,Для определения антибиотической активности фракции используют Streptococcus p-sogenes. Колонку делят на 10 равных частей (включая загрузку) э. Образцы насадки отбирают при ,05, 0,15, 0,25, 0,35 и т,д, по д/гине всей колонки, В местах, где полосы антибиотика накладываются, отбор производят через каждую 1/8 Rf„ Каждый образец элюируют 10 мл смеси этилацетат хлористый метилен-метанол (2:2:1) и по данным тех в системе этил ацетат хлороформ (1:1) и по обугливанию в присутствии серной кислоты определяют наличие антибиотика.
Образцы cTijO ,11-0 , 35 вырезают из колонки и взмучивают в смеси этилацетат-клористый. метилен-метанол (2: :2:1),фильтруют,промывают этой же смесью растворителей и концентрируют в вакууме досуха,. Остаток растворяют в трет-бутаноле, лио илизируют и получают 26,7г продукта,
600 мл нижней фазы сис1 емы н-гептан-метанол-этилацетат-вода (3000: 1500:75:37 по объему) и 800 i- промытой кислотой диато 1итовой земли смеивают, загружают в стеклянную коонку смесь, состоящую из 40 г диатомитовой , 30 мл нижней фазы указанной системы и .13,8 г лиофилизированного продукта, элюируют верхней фазой указанной системы растворителей и собирают фракции по
25 мл, которые анализируют методом тех. Фракции 90-150 объединяют и получают 2, 75 г антибиотика ВЬ 508й в виде натриевой соли.
Пример 4 Смешивают 600 мл нижней фазы системы гептанметанолэтилацетат-вода (3000:1500:80:40 по объему) и 800 г диатомито1эой земли „
В колонку загружают смесь 28 г диатомитовой земли, 21 мл указанной нижней фазы, 10,9 г антибиотика ВЬБОЗд в виде натриевой соли, элюируют верхней фазой указанной система, отбирая фракции по 90 мл. По данным тех на пластинках силплейт
F 22 в системе зтилацетат-хлороформ и по обугливанию судят о нбшичии антибиотика. Фракции 29-39объединяют, концентрируют, твердый. остаток растворяют в трет-бутаноле, лиофилизируют и получают 4,79 г продукта,
800 мг лиофилизированного продукта перемешивают с 300 мл смеси водаэфир-петролейный эфир (2:1:1), При перемешивании добавляют 1 н, соляную кислоту до рН 2,5, Органическую фазу отделяют и три раза промывают равными объемами воды, концентрируют в вакууме, остаток растворяют в трет-бутаноле, лиофилиэируют и получают 657 мг антибиотика ВЬ508л в виде свободной кислоты, fotj -f21 ± 1° .(с 0,9, метанол) ,
Найдено,%.: е 61,1; Н 8,9; зола О - ИК-спектр, мкм: 2,95; 5,88; . 8,35; 8,60; 9,00; 9,12; 3,43; 9,62; 10,05 и 10,47,
Пример 5, 1г антибиотика ВЬ508д в виде свободной кислоты расворяют в 300 мл смеси эфир-петролейный эфир .(Д:1) , добавляют к 200 мл воды, при перемешивании добавляют 0,1 н, соляную кислоту до рН 10,0, органическую фазу отделяют концентрируют в вакууме,, остаток растворяют в 10 мл эфира, добавляют 20 мл петролейного эфира (30-70°е) и кристаллик натриевой соли антибиотика BU 508л, выдерживают при 4е, кристаллы промывают холодным петролейным эфиром, сушат на воздухе и получают 323 мг натриевой соли антибиотик В1, 508й., т,шт. 157-161° е; + 6 ±1°(с , метанол),
Найдено,%: С 60,99; Н 8,47; Na 1,95,. .
ИК-спектр, мкм: 6,27; 7,28; 9,0; 9,13; 9,48 и 10,60,
Пример 6, 1г антибиотика BU 508Д в виде натриевой соли, 834 мг п-бромфенацилбромида, 600 мг карбоната лития и 20 мл сухого диметилформс1мида выдерживают 16 ч при 37°е, добавляют 4-кратный объем хлороформа, фильтруют, фильтрат концентрируют в вакууме и получают сиропоподобный остаток, 90 мл нижней фазы системы гептан-этилацетат-метанол-вода (200:25:1000:17) смашвают со 120 г диатомитовой земли, В колонку загружают сиропоподобный остаток 12 г диатомитоБОй земли и 9 мл нижней фазы указанной системы, элюируют верхней фазой, отбирая фракции по 10 мл. Активность фракций определяют методом тех. Фракции 22-41 .объединяют и концентрируют в вакууме, остаток растворяют в 50 мл метанола и фильтруют. Фильтрат нагревают на паровой йене, добавляют 10 мп воды и дают медленно охладиться до 4 С. Получают 566 мг кристаллов бромфенациЛового эфира антибиотика BU 508д,1:л3 5:-«-бЗ ±2°(с 51, хлороформ).. Найдено,%: С 58,80; Н 7,80 Вг 8,64, КМ- 2,9 6,30; 8,20;8,45;8,бО; 9,00; 9,15 (широкая) 9,37 (широкая); 9,62; 10,06 и .
Х«ГЬ
отличающийся тем, что Siif-epiowces iisef-oscopicus, 8180 выращивают в аэробных условиях в жидкой, питательной среде, содерИ к
О , в CHj
Н он
жащей источники углерода, азота и минеральные сапи, с последующем выделением целевого продукта. 4 Молекулярный вес иадюгиаратй п-бромфенацилоБого афирй В). 508., определенный дифракцией рентгеновских лу ей , равен 1 i i 4 t О ,, 3 8 , Предлагаег-й й способ позволяет получить антибиотик в 1 508й,, обладающий высокой актквность5о против кокковых инфекций теплокровных животных и невысокой токсичностью. Форьтула изобретения Способ получения антибиотика формулы
