Изобретение относится к микробиологической промьшшенности, в частности к производству антибиотиков.
Целью изобретения является создание спосо.ба получения новых антибиотиков, активными против грамположительных микроорганизмов.
Для осуществления способа используют штамм Nocardia orientalis NRFL 15232, который характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки.
Имеет субстрактньй и воздушньй мицелий. Воздушные гифы похожи на паутину, при глубинном культивироваии в условиях встряхивания разрьгоатся на короткие фрагменты.
Рельеф споровой поверхности гладий. Форма споры меняется от сферической до цилиндрической. Образует споры в незначительном количестве и нерегулярное
Солодовый агар с дрожжевым экстрактом (МСП 2), Рост обильный, складчатая поверхность. Воздушный мицелий обильный, серый. Раствориый пигмент красновато-коричневый.
Крахмальный агар с неорганическими солями (МСП № 4. Рост обильный, воздушный мицелий обильный, перламутровый белый. Растворимый пигмент отсутствует.
Глицерин - -аспарагиновый агар (МСП № 5). Рост обильный. Воздушный мицелий обильный, перламутровый белый. Растворимый пигмент свето-коричневьй.
Тирозиновый агар (МСП № 7). Рост обильный. Обратйая сторона колонии черного цвета. Воздушный мицед1ий обильньй, желтый. Растворимый пигмент темный, красновато-коричневый.
Агар Чапека. Рост хороший. Воздушньй мицелий хороший, перламутровый белый. Растворимый пигмент светло-коичневый.
Агар Эмерсона. Рост обильный, орщинистьй, слоистый. Воздушньй миелий хорошо развит, бледно-желтьй.
Глицерин - глицин . Рост обильньй. Воздушный мицелий обильный, перамутровый серый. Растворимьй пигмент оливково-коричневьй.
Цельные клетки по сахарному состау относятся к типу А, а клеточная оболочка - к типу ТУ;
Физиолого-биохимические признаки.
Каталаза положительная.
Разлагает козеин, ДНК, гипоксантин тирозин, мочевину, ксантин, не разлагает аденин.
Желатину разжижает.
Гидролизует зскулин, снятое молоко крахмал.
МеЛаноидная пигментация отрицательная. Нитрит из нитрата не образует.
Фосфатаза положительная.
Совместимость с NaCl 8%.
Устойчив к лизоциму, пенициллину, рифампицину; чувствителен к бацитрацину, новобмоцину.
Вырабатывает уреазу. Усваивает углеродсодержащие соединения и органические кислоты.
I
Грамположительный. ВьЕкивает при. 8ч. Температурньй интервал 10-40 С. Сбраживает углеводы до кислоты: L (+)арабинозу, целлобиозу, i-эритрит фруктозу, д(+)галактозу, глюкозу, глицерин, i-инозитол, инулин, d(+)лактозу, d(+)мaльтoзy, й(-)маннкт, d(+)MaHH03y, 4(+)мелезитозу, cs -метилD-глюкозид, салицин, сахарозу, d(+) трефалрзу, d(+)ксилозу; не сбраживает адонитол, целлюлозу, дульцитол, d(+.)мeлибиoзy, .d(+)paфинoзy, Ь(+)рамнозу d()copбит.
Пример 1. Получение посевной культуры первой стадии.
Для вьфащивания Nocardia orientalis NRRL 15232 на скошенном агаре готовят следующую среду, г/л: термически обработанная овсяная мука 60,0: дрожжи 2,5; Kj,HPO 1,0; исходный минеральный раствор Чапека 5,0 мл/л; агар 25,0; дистилл.ированная вода до 1,0.л.
Исходньй минеральньй раствор Чапека -5сод%ржит, г/100 МЛ5 КС1 10,0; 10,0; ,0 0,2; дистиллированная вода до 100 мл.
Перед стерилизацией раствор с рН 6,2 доводят до рН 7,3 водным раствором гидроокиси натрия. После стерилизации рН среды 6,7.
Споры штамма высевают на скошенный агар вьш1еуказанного состава и инкубируют в течение 7 дней при . Затем культуру заливают стерильной дистиллированной водой и снимают культуру стерильным инструментом для диспергирования спор и мицелия. 1 мл споровой суспензии используют для засева 50 мл вегетативной среды, имеющей следуюпщй состав, г/л: картофельньй декстрин
3
30,0; патока 20,0; бактепентон 7,0;, с -тирозин 1,0; дистиллированная вода до 1,0 л; рН 5,5. Доводят рН до 7,0, водным раствором гидроокиси натрия перед стерилизацией, после стерилизации рН 6,1.
.Вегетативный посевной материал инкубируют в 250 мл широкогорлой колбы Эрленмейера при 30 в течение 48 ч на аппарате для встряхивания, вращающемся по Дуге диаметром 5,08 см со скоростью 250 об/мин. Эту инкубационную среду используют либо для засева небольших ферментаторов (концентрация засева 0|8 об.% в об.среды),.либо для засева сосудов второй стадии, предназначенных для получения большего объема мицелия.
Ферментация А 51568,1.
100 л ферментационной среды засевают 0,8% (800 мл) вышеописанной культуральной жидкостью.
Ферментационная среда имеет, следующий состав, .г/л: полипропиленгликоль (2000) 0,2; картофельный декстрин Difco 30,0; патока 20,0; бактопептон Difco 7,0; oi-тирозин 1,0; дистиллированная вода до 100 л; рН.5,2. Водным 5N раствором гидроокиси натрия доводят рН среды до 7,1, стерилизуют при 121°С и давлении 1,19 - 1,33 кг/см в течение 45 мин. После стерилизации рН среды 6,2.
Ферментацию ведут в 165-литровом ферментационном танке в течение приблизительно 114 ч при 30.С. Аэрацию ведут со скоростью 0 15V/V/ /мин и перемешивают обычной мешалкой со скоростью около 200 об/мин. Накопление антибиотика в культуральной среде контролируют центрифугированием образца культуральной. жидкости при 1000 g и декантируют супернатант для анализа. Образец разбавляют фосфатным буфером с рН 6,0 и подвергают микробиологическому анализу испытанием на чашке с агаром с использованием Micrococcus luteits АТСС 8341 в качестве теста-микроба.
П р и м е р 2. Вьщеление антибиотической А51568-смеси.
К 3 л культуральнай жидкости, содержащей факторы А и В в соотношении приблизительно 95:5, добавляют фильтровальный брикет (кизельгур) и смесь отфильтровывают. 2,7 л фильтрата с рН 7,8 наносят на смолу
942Й5Л
Diaion НР-20 (высокопористый стиролдивинилбензольный сополимер в форме шариков), помещенную в колонку размером 3x25 см. Элюент отбрасьша5 ют и колонку промывают 1 л воды и 500 мл 25%-ного раствора метанола в воде. Смесь антибиотиков элюируют из колонки дважды по 500 мл 50%-го водного раствора метанола. ФактоtO РЫ А и В одинаково, адсорбируются на НР-20 и элюируют с этой смолы в одинаковых условиях.
Фракции элюата оценивают на антибиотическую активность с использованием В. suhtilis. Более активные фракции концентрируют до небольшого объема и лиофилизуют. Получают сырую антибиотическую А 51568-смесь весом 905 мг. .
20 П р и м е р 3. Очистка антибиотической А51568-смеси.
Сырую антибиотическую смесь растворяют в 50 мл воды и наносят на колонку размером 1,7x44 см, заполненную
25 Сефадексом СМ-25 в .е. Элюент отбрасьшают, колонку промывают 250 мл воды. Затем колонку элюируют злюентом, в котором концентрация бикарбоната аммония нарастает по вогнутой
2JJ кривой ( 1 йчейка смешения 100 мл). Собирают 50 фракций
. по 25 мл и проверяют их на антибиотическую активность с использованием В,subtilis..
Факторы А и В элюируются в различ35ных фракциях. Для обессоливания продукта отобранные фракции с фактором А наносят на хроматографическую колонку размером 1,7x10 см, запаенную смолой Diaicn НР-20, которую предва40рительно вьщерживают в воде до равновесного набухания, и колонку промывают водой, после чего элюируют 100 мл 50%-го водного раствора метанола. Метанольный элюат вьшаривают до сухо45го остатка. Остаток растворяют в небольшом количестве воды и подкисляют О, IN водным раствором хло ристоводородной кислоты. Затем подкисленную смесь лиофилизируют. Получают 25 мг
очищенного антибиотического А51568фактора А.
Для выделения фактора В используют методику по примеру 3 с использованием анализа с помощью жидкостной хроматографии высокого давления вместо анализа с помощью В.subtilis.
Отдельно отобранные фракции обессоливают аналогично фракции А 5 и получают один продукт, обоггиценНЫЙ фактором А, и второй продукт, обогащенный фактором В. П р и м е р 4. Выделение, очистка и разделевие А51568-фактороЕ А и В. Для отделения А51568-смеси фактороз А и В от культуральной жидкос ти последнюю фильтруют через фильтр Hyflo supercel. После доведения фильтрата до рН 6,0-6,5 с помощь.ю 5NHC1 прибавляют смолу Jonac Х-236(Н) и смесь перемешивают для адсорбции антибиотиков. Супернатант отбрасывают и смолу промывают водой (10 V смолы). После отбрасывания промьюных вод смолу Х-236 помещают в колонку, которую элюируют О,IN раствором хлорида аммония (5 V колонки), фракции объемом -4 л сразу нейтрализуют 5N НС1. Сонтролируют антибиотическую активность с помощью S.aureus и жидкостной хроматографии высокого давления Фракции, содержащие А 51568-факторы А и В, отбирают и для обессолива ния.смеси пропускают через колонку со смолой Diaion НР-20. Элюент отбрасывают. Затем смолу элюируют 5%-ным раствором изопропилового спи та, содержащим 0,1% HjPOj. Фракции по 500 мл собирают и определяют в них антибиотическую активность. Активные фракции соединяют, концент рируют и лиофилизируют. Для дальнейшей очистки продукта и одновременного разделения факторов А и В загрязненную смесь факторов А и В растворяют в воде и наносят на колонку с СМ-сефадексом с-25 Колонку элюируют, линейным градиентом от воды до 0525N . Фракции анализируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления и фракции, содержащие фактор А, собирают отдельно от фракций, содер жащих фактор В. Для удаления соли, добавленной на предьвдущей стадии, каждый набор фракций наносят на колонку со смоло Diaion НР-20, которую элюируют 5%-ным раствором изопропилового спирта, содержащего 0,1% HjPO. Соответствующий набор фракций на каждой колонке отбирают на основании анализа с помощью жидкостной хроматографии высокого давления. Для набора фракций концентрируют. 856 лиофилизируют и получают соответственно практически чистый А51568фактор А и практически чистьй А51568-фактор В. Антибиотик А51568-фактор А представляет собой белое, аморфное твердое соединение. Элементный состав, %: углерода 50,635 водорода 5,07; азота 8,36; хлора 8,19; кислорода 25,16. Молекулярный вес около 1435. Эмпирическая формула C yH-jjCljNgO . Потенциометрическим титрованием фактора А в 66%-ном водном растворе диметилформамида получают значения рКа, равные 6,2; .8,8; 10,3 и 12,85 (первоначальный. ,12) . , „j. Удельное, вращение: 20,4 (С-10 мг/мл, вода), Г.,6 ( МГ/1УШ, вода). Спектр инфракрасного поглощения в таблетке из КВг, максимум поглоще ния: 3400 (широкий, сильный), 3380 (пюрокий, сильный), 1657 (широкий, сильный), 1387 (средней интенсивности), 1505 (средней интенсивности), 1424 (средний), 1396 (средний), 1328 (широкий, слабый), 1310 (широкий,; слабьй), 1231 .(средней интенсивно.сти) ,1174 (слабьй) , 1156 (слабьй) , 11/8 (средний), 1062 (средней интенсивности), 1028 (слабый), 1015 (слабый) , 990 (слабый), 882 (слабьш), 88t (слабый) см УФ - спектрофотометрия: кислотные или нейтральные условия, макс., нм (t):278 (5500), 234 (плечо) (25000). Щелочные условия, макс. нм ():302 (6000), 264 (плечо) (10000). Антибиотический А51568-фактор В белое, аморфное твердое соединение.. Молекулярная масса около 1437. Эмпирическая формула С 45 К тгСХ .. Протонный ЯМР - спектр фактора В схож со спектром ванкомицина и фактора А, но отличается отсутствием резонанса N-CH,N - ристил/лейцина, имеющего место в спектре ванкомицина и. аспарогиновых резонансов, найденных в спектрах ванкомицина и фактора А, в спектре фактора В имеются оезонансы глутамина. Проявляет активность по отношению к аэробным и анаэробным бактериям, таким как Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis Streptococcus pyogenes. Streptococcus pneumonial. Streptococcus species,
7 11942858
Haemophilfis influenzae, Escherichiafragilis, Bacteroides fchetaiotaoraiccoli, Klebsiella pneumoniae,ron, Bacteroides melaninogenicus,
Clostridium difficile, ClostridiumBacteroidS vulgatis, Bacteroides
perfrlngens, Clostridium septicum,corrodens, Fusobacterium sumbiosum,
Eubacterium aerofaciens, Peptococcus5 Fusobacterium necrophorum.
asaccharolyticus, Peptococcus prevo-Антибиотики или их фармацевтичесti, Peptostreptococcus anaerobius,ки приемлемые соли применяют для леPeptostreptococcus intermedius, .чения инфекций у людейи животных, при
Propionifacterium acnes,Bacteroidesэтом .эффективнаядоза равна25-2000 мг.
Способ получения антибиотиков формулы .
