Способ сортовой идентификации пшеницы Советский патент 1989 года по МПК A01H1/04 

1

Изобретение относится к биотекно- логин, а именно к биохимии растений, и может быть использовано в области .селекции и семеноводства пшенищ,; и Других злаков.

Цель изобретения - повышение раз решающей способности сортовой идентификации.

Возможными путями повьшения разре- тающей способности сортовой идентификации являются либо увеличение эффективности фракционирования запаскык белков, предел которой .практически достигнут, либо использование для этих целей других полиморфных систем белков. Установлено, что белки-ингибиторы химотрипсина-рубтилизина, содержащиеся в зерне (муке), являются высокополиморфными белками, отражающими сортовое разнообразие пшеницы; и других злаков (например, ржи).

Способ заключается р том, сортовую идентификацшо яерна и пше- ницы и других злаков проводят после фракционирования белков зерна электрофорезом или кзозлектрическим фокусированием по спектрам ингибиторов хи- мотрипсина-субтилизина, , Способ осуществляют следующим образом.

Навески.зерна, отдельные зерновки или часть их эндосперма размалывают. Белки извлекают из муки 4-кр.атным объемом воды (2 М мочевины, буфера / или другого экстрагента). Смесь центрифугируют, осадок отбрасывают. Проводят изоэлектрическое фокусирование () белков в пластине 6%-ного ПААГ

толщиной 0,2-0,3 MMj содержащего 2% амфолина, сервалитов или амфолитов стечественного производства с интервалом рН 4-9.

Образцы наносят на гель с помощью бумажных полосок в объеме 5-30 мкл в зависимости от чувствительности применяемого способа выявления ингибиторов.

После ИЭФ в разделяющем геле выявляют ингибиторы химотрипсина-субтили- зина. Выявление ингибиторов может осуществляться методами, в которых используется желатиновый слой фотопле- нок либо искусственные аналоги субстратов протеиназ . Поскольку данные ингибиторы бифункциональные, для проявления их.спектров можно использоват любую из указанных протеиназ. Незна- чительные отличия между спектрами, проявленные химотрипсином и субтили- зином, связаны с присутствием нескольких компонентов специфичных ингибиторов каждого из этих ферментов. Мень- шее число лишних компонентов наблюдается при проявлении спектров химо- трипсином, однако последний можно использовать с ограниченным набором типов фотопленок. В свою очередь не- пользование субтилизина обеспечивает несколько более высокую чувствительность анализа, более ровный фон и возможность работы со многими типами фотопленок.

По первому варианту метода выявления спектров ингибиторов на гель накладывают бумагу, смоченную раствором протеиназы в 0,1 М (концентрация химотрипсина 10-15 мкг/мл, суб- тилизина - 20 - 30 мкг/мл). Через 10 мин бумагу удаляют и на ее цесто накладывают фотопленку. Через 10-vl 20 мин инкубации при 30-40 С фотопленки накладьшают на влажную фильтро- вапьную бумагу. Последнюю слегка подсушивают сухой бумагой и отделяют от нее фотопленку. На фотопленке ингибиторам соответствуют темные полосы на светлом фоне..

По второму методу после ИЭФ на гел накладьшают фотопленку на 20 мин, затем переносят ее на бумагу, смоченную раствором химотрипсина (2-3 мкг/ /мл) или субтилизина (4-6 мкг/мл) в 0,1 М и инкубируют в . таком виде 30-40 мин при 30-40 С. Бумагу подсушивают листом сухой бумаги и отделяют, фотопленку.

g

-

0

5

Более высокое кач. во спектров пол-учают при использовании в качестве поддерживающей среды вместо бумаги гель 0,8%-ной агарозы, содержащей 0,1 М и протеиназу. Способы с использованием синтетических аналогов субстратов менее удобны из-за низкой чувствительности.

Спектры ингибиторов из разных образцов сгрна сопоставляют между -собой или со спектрами из предварительно составленного каталога. Можно записать спектр ингибиторов в виде формулы, предварительно обозначив возможные позиции компонентов в спектре.

Способ основан, в частности, на том, что образцы, сходные по локусам глиадина, могут отличаться по другим локусам, в 4acTHocTii о локусам ингибиторов, если эти образцы не полностью идентичны. Спектры ингибиторов химотрипсина-субтилизина у разных сортов и линий пшеницы, ржи и других злаков значительно отличаются по компонентному составу. Уровень различий, выявляемых между образцами зерна, сопоставим с тем, что характерен для глиадинов, а в ряде случаев превосходит его..

П р и М е р 1. Идентификация сортов, пшеницы по ингибиторам химотрипсина-субтилизина .

Зерна размалывают, белки извлекают 4-кратным объемом воды, смесь центрифугируют. ИЭФ проводят на готовой пластине 110 х 240 мм. В качестве анодного буфера используют смесь 0,04 М аспарагиновой и глутаминовой кислот, катодного - 2%-ные амфолины с рН 9-11.

Образцы наносят на гель с помощью бумажных полосок 10 х 5 мм в объеме 20 мкл на расстоянии 15 мм от анода. На пластину шириной 110 I-IM наносят 15 образцов. Расстояние между электродами 160 мм (разгонку ведут вдоль пластины).

ИЭФ ведут на приборе Мультифор П при мощности тока 8 Вт и напряжении 2500 В в течение 2 ч. Затем на гель накладывают предварительно увлажненную фотопленку. Через 20 мин пленку снимают, высушивают и накладывают на пластину 0,8%-ной агарозы, содержащей 0,1 М и химотрипсин (4 мкг/мл). Сверху помещают гибкую

пласткновую гренку для предотвращения подсыхания фо опленки и агарозы.

Инкубацию ведут при 30 С в течение 35 мин. Фотопленку помещают на лист влажной гладкой фильтровальной бумаги, слегка подсушивают и отделяют фотопленку. Ингибиторам соответствуют темные полосы на светлом фоне. Раз личные сорта пшеницы отличаются по спектра ингибиторов. По результатам анализов составляется каталог спектров ингибиторов, характерных, для разных сортов, по которому в , дальнейшем сверяются при сортовой идентификации.

Пример 2. Сортовая идентификация зерна у сортов, трудноразличимых по глиадинам.

Сорта Саратовской группы селекции трудноразличимы по глиадинам. Саратовская 36, Саратовская 42 и Саратов471999

ния

ние т ауРазг

ская 44 практически неразличимы межд.у собой, а у Саратовской 33 и Саратовской 39 отличия по спектру глиа- динов незначительные.

Зерновки разрезаются пополам. У одной половинки определяют спектр глиадинов, а у другой - ингибиторов (см. пример 1). При проявлении спект1Q ров используют химотрипсин. Зерновки, не различимые по глиадинам, четко отличаются по спектрам ингибиторов.

Формула изобретен и. я

Способ сортовой идентификации пшеницы, включающий фракционирование белков зерна, отличающийся тем, что, с целью повышения разрешающей способности, сортовую идентификацию проводят по спектрам ингибиторов химотрипсина-субтилизина.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к биохимии растений, и может быть использовано в области селекции и семеноводства пшеницы и других злаков. Целью изобретения является повышение разрешающей способности сортовой идентификации. Способ состоит в том, что сортовую идентификацию проводят после фракционирования белков зерна электрофорезом или изоэлектрофокусированием по спектрам ингибиторов химотрипсина-субтилизина. Способ позволяет идентифицировать сорта со сходными или близкими спектрами глиадина ,в частности, сорта с общей родословной, которые не всегда возможно идентифицировать традиционными методами по спектрам глиадинов.