Способ идентификации D-рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы Советский патент 1989 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к биохимии растений, а именно к сйособам идентификации ферментов в геле после электрофореза, и может быть использовано также в генетике и селекции растений.

Цель изобретения - упрощение и ускорение процесса.

Способ осуществляют следующим образом.

Навеску листьев исследуемых растений (например, огурца или пшеницы) растирают с небольшим объёмом буферного раствора, фильтруют и центрифугируют, получая экстракт легкорастворимых белков, которые затем подвергают электрофоретическо- му фракционированию в геле. После фракционирования гель извлекают из

трубки и заливают окрашивающим водным нейтральным раствором феназин- . метасульфата с концентрацией 0,15 - 0,35 мас.%.

Пример 1. Навеску листьев огурца измельчают в равном (1 г : : 1 мл) объеме трис-глицинового буфера (рН 8,3), фильтруют ицентрифу- гируют. В дальнейшей работе используют надосадочную жидкость. Фракционирование полученной белковой смеси проводят в трубках с полиакриламид- ным гелем (100x8 мм). Состав геля,%: акриламид 7,5; метиленбисакриламид 0,2. Гель полимеризуют при комнатной температуре, добавив 5,75 мкл ТЕМЕД , и 5 мл О,14%-ного раствора персульфата аммония на каждые 10 мл гелево- го раствора. Белковый экстракт нанр3149

сят на гель в количестве 100 мкл и сверху наслаивают трис-глишиювый буфер СрН 8,3). Предэлектрофорез проводят при силе тока мА на каждую трубку в течение 30 мин,затем силу тока увеличивают в 2 раза. Продолжительность фракционирования 2,5 ч.

После электрофореза гели извлекают из трубок, однократно споласкивают дистиллированной водой и окрашивают в водном растворе феназинмета- сульфата (ФМС) с концентрацией 0,25% для идентификации РДФК/0, После 30 мин инкубации геля в окрашивающем растворе на бледно-желтом фоне геля четко проявляется ярко-розовая, полоса , в месте локализации РДФК/0.

Пример 2. Способ осуществляют согласно примеру 1,за исключением того, что для окраишвания используют водные нейтральные растворы феназинметасульфата с концентрациями 0,10; 0,13; 0,25; 0,35 и 0,40 масо%. Визуальный анализ результатов окрашивания показывает следующее. Оптимальной для окракивания гелей является концентрация водного раствора ФМС 0,15-0,35 мас,%, при которой высокая интенсивность (яркость) розовых полос в местах локализации РДФК/0 сочетается с высокой скоростью их проявления и слабой фоновой окраской геля.

Уменьшение концентрации ФМС до 0,10 масо% сопровождается увеличе

74

нием продолжительности окрашивания и снижением интенсивности полос РДФК/0, что существенно, за-трудняет визуальное обнаружение (идентификз- идю) фермента.

Увеличение концентрации ФМС выше 0,35 мас,% несмотря на высокую скорость процесса окрашивания приводит к сильному потемнению остальной части геля, что также препятствует идентификации РДФК/0 (снижается избирательность реакции).

15 Формула изобретения

Способ идентификации D-рибуло- ЗО-1,5-дифосфаткарбоксилазы, включающий получение экстракта легкораст- воримых растительных белков с сохранением естественного соотношения концентраций белковых компонентов, злектрофоретическое разделение их смеси в геле с последуюшдм окрашиванием геля в водном растворе красителя до появления цветных зон в местах локализации идентифицируемого фермен

та, отл.ичающиися тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса, в качестве красителя ис-. пользуют водный нейтральный раствор феназинметосульфата с концентрацией 0,15-0,35 мас.%,а процесс окрашива- 1ШЯ проводят до появления в геле зон розового цвета в местах локализации В-рибулозо-1,5-дифосфаткарбок- сялазы.

Изобретение относится к биохимии растений, а именно к способам идентификации ферментов в геле после электрофореза, и может быть использовано также в генетике и селекции растений. Цель изобретения - упрощение и ускорение процесса. Для осуществления способа экстракт легкорастворимых растительных белковых с сохранением естественного соотношения концентраций белковых компонентов подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля водным нейтральным раствором феназинметасульфата с концентрацией 0,15-0,35 мас.% до появления в геле зон розового цвета в местах локализации идентифицируемого фермента.