Способ получения монослоя эритроцитов для проведения иммунологических реакций Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 

. Изобретение относится к иммуноло гии и может найти применение при экспериментальных и клинических исследованиях. Целью изобретения является упрощение способа. Способ осуществляют следующим образом. Чашки Петри (ЗСЮ мм) тщательно обезжиривают в смеси Никифорова в течение 24-48 ч. Перед постановкой опыта бинтом насухо протирают внутреннюю поверхность и наливают в каждую по 4 мл О,2%-ного раствора поли-N,N-димeтил-N,N-диаллиламмонийхлорида (ПДМДААХ), инкубируют при комнатной температуре в течение 60 мин, посл,е чего раствор поликатиона сливают, чашки трижды про мывают забуференным физиологическим раствором хлористого натрия с рН 7,2. Из трижды отмытых эритроцитов барабана готовят 4%-ную взвесь в каждую чашку вносят по 4 мл взвеси и инкубируют при 37 С в теч ние 30 мин. Затем чашки тщательно отмьтают большим объемом забуференного физраствора для удаления неприклеевшихся к стеклу эритроцитов. Равномерность созданного моно слоя проверяют при помощи сбетовог микроскопа. Исследуют лимфоциты периферичес кой крови здоровых доноров. В тщательно обезжиренные чашки Петри нал вают по 4 мл О,2%-ного раствора ПДМДААХ, инкубируют 2 ч, после чег раствор сливают, чашки трижды пром вают забуференным физиологическим раствором хлористого натрия. Из от мытых эритроцитов готовят 4%-ную взвесь, в каждую чашку вносят по 4 мл взвеси и инкубируют при З7с 72 течение 30 мин. Затем чашки тщатель- но отмывают больЕМм объемом забуференного физраствора для удаления неприкрепившихся эритроцитов. Монослой используют для определения количества клеток, обуславливающих антителозависимую цитотоксичность (К) и естественную (ЕК). Для определения К-клеток монослой в течение 30 мин обрабатывают кроличьей антисывороткой против эритроцитов барана с преимущественным содержанием IgG. По истечении срока инкубации чашки трижды промывают забуференным физраствором и наливают по 4 мл культуральной среды (199, мономицин 1000 мкг/мл, 1% сыворотка 1У (АВ) группы человека, 0,5% HEPES), содержащей 0,5-1,0 хЮ КЛ./МЛ. Мононуклеарные клетки выделяют на одноступенчатом градиенте фиколл-верографина с удельным весо 1,077 г/см . Чашки с клетками инкубируют 18 ч при 37 С и атмосфере СО. Затем монослой клеток фиксируют 0,6%-ным раствором глутарового альдегида, окрашивают азур-11эозином и изучают под световым микроскопом. Подсчитывают 500 лимфоцитов, вьщеляя среди них клетки, образующие вокруг себя зону гемолиза-бляшку, соответствуюшую не менее 10 эритроцитам. Результаты выражают в процентах и абсолютных числах на 1 мкл крови. Чашки с монослоем эритроцитов, не покрытых антителами, служат для подсчета ЕК-клеток. При изучении количества К- и ЕК-клетоК у 10 здоровых доноров в возрасте 19-31 года установлено, что количество К-клеток равно 1,59±0,13 (30,8±1,5 в мкл), ЕК-клеток к эритроцитам барана 0,8+0,15% (16,5j:3,1 в мкл).

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОСЛОЯ ЭРИТРОЦИТОВ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИММУНОЛО1ГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ путем обработки поверхности стекла или пластика раствором поликатионита с последующим нанесением эритроцитов и промыванием, о тличающийся тем, что, с целью упрощения способа, обработку . осуществляют 0,2-0,25%-ным раствором поли-N,N-димeтил-N,N-диаллиламмонийхлорида в течение 60-120 мин и для нанесения используют 4%-ную взвесь эритроцитов.