СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АТОПИЧЕСКИХ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для выявления аллергических состояний у взрослых и детей.

Диагностика атопических аллергических заболеваний проводится обычно на основании анамнеза и клинических проявлений, однако постановка диагноза в начале заболевания и вне обострения по этим показателям затруднительна. В связи с этим особое значение приобретает лабораторная диагностика атопической аллергии. В настоящее время лабораторное подтверждение диагноза основывается на определении эозинофилов в крови и секретах, проведении кожных проб, определении Ig Е и аллергенспецифических Ig Е-антител (4,6).

Известен способ диагностики атопических аллергических заболеваний, основанный на определении числа эозинофилов в крови. Точность этого метода недостаточна из-за большого колебания индивидуального содержания эозинофилов в крови (50-350 клеток/кмл х10⁹/л) (6). Этот способ диагностики связан с необходимостью взятия крови, что опасно из-за возможности инфицирования, в том числе и вирусами СПИДа, гепатита В при отсутствии одноразовых инструментов или несоблюдения правил стерилизации.

Прототипом способа является эозинофилов в секрете слизистой носа (4). Этот способ безопасен и прост в техническом исполнении. Диагностическим критерием считается сам факт присутствия эозинофилов в мазке из носа (1, 4, 7, 10, 11, 12).

Недостатками прототипа являются:
недостаточная специфичность способа, он не позволяет дифференцировать местную эозинофилию неаллергической природы от истинных атопических аллергических заболеваний (эозинофилы в носовом секрете могут встречаться при ринитах неаллергического происхождения (9), у здоровых детей раннего возраста (1), в значительном количестве они могут появляться местно в очаге при стойком гнойном процессе с резко выраженными признаками деструкции клеток (3);
отсутствие четкого диагностического критерия с цифровым выражением;
способ недостаточно точен, так как он характеризует только факт появления эозинофилов без оценки их функциональной активности, что не позволяет выявить клинически невыраженные формы.

Цель изобретения - повышение точности и специфичности определения атопических аллергических заболеваний.

Сущность способа заключается в том, что в секрете слизистой носа определяются эозинофилы, образующие розетки с эритроцитами барана, сенсибилизированными гистамином.

Поставленная цель достигается тем, что на мазок из секрета слизистой носа наливают 0,5% взвесь эритроцитов барана, предварительно сенсибилизированных гистамином, инкубируют, фиксируют в парах формалина и этиловом спирте, препарат окрашивают, микроскопируют, подсчитывают содержание эозинофилов, а среди них - процент розеткообразующих клеток. При обнаружении в мазке более 5% розеткообразующих эозинофилов (РОЭ) диагностируют атопическое аллергическое заболевание.

Способ осуществляли следующим образом.

Предварительно сенсибилизируют эритроциты барана гистамином (2). Приготовление эритроцитарного диагностикума: эритроциты барана обрабатывают глютаровым альдегидом, соединяя 0,5 мл 5% взвеси тщательно отмытых свежих эритроцитов с 0,25% приготовленным раствором глютарового альдегида в соотношении 1: 1. Смесь выдерживают при температуре 37^оС в течение 15 мин, после чего эритроциты дважды отмывают от альдегида забуференным изотоническим раствором хлорида натрия (рН = 7,2) и доводят этим же раствором до первоначального объема (5% взвесь). для сенсибилизации эритроцитов готовят раствор гистамина с концентрацией 0,1 мг/мл на забуференном физиологическом растворе (рН = 6,4). 1 мл взвеси глютаризированных эритроцитов цинтрифугируют, надосадочную жидкость удаляют, а к осадку эритроцитов приливают 1 мл раствора гистамина. Смесь тщательно встряхивают и выдерживают при температуре от 20 до 22^оС в течение 25-30 мин, после чего эритроциты дважды отмывают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин изотоническим раствором хлорида натрия (рН = 7,2) и им же доводят взвесь до 1/10 первоначального объема (0,5% взвесь).

Материалом для исследования служат выделения из полости носа больных. Для взятия материала в нижний носовой ход вводят ватно-марлевый тампон, прижимают его к латеральной стенке и делают 1-2 оборота для снятия выделений. Из материала делают мазок, высушивают его на воздухе, фиксируют в парах формалина 40% (в эксикаторе) 5-7 мин, после чего на стекло наливают 0,5% взвесь эритроцитов, сенсибилизированных гистамином, инкубируют 15-20 мин в термостате при 37-37,5^оС, затем помещают в эксикатор на 5-7 мин в пары формалина. Взвесь эритроцитов сливают, смывают изотоническим раствором хлорида натрия, мазок высушивают на воздухе, фиксируют 15-20 мин в 96^о-ном этиловом спирте, окрашивают по Романовскому-Гимзе 15-20 мин, микроскопируют под иммерсией, просматривая 100 эозинофилов, отмечают среди них число (%) клеток, фиксировавших на себе 3 и более эритроцитов.

0,5% взвесь бараньих эритроцитов берут для любой реакции розеткообразования, в данном случае определяют розеткообразующие эозинофилы.

15-20 мин - это время контакта, необходимое для связывания рецепторами, находящимися на мембране эритроцитов, маркеров - медиаторов воспаления, каковыми являются эритроциты барана, сенсибилизированные гистамином.

37-37,5^оС (температура в термостате) - температура тела, оптимальная температура для протекания всех биологических реакций in vitro.

15-20 мин - это время, необходимое для фиксации мазков в этиловом спирте.

96^о - это крепость этилового спирта, которая не вызывает разрушение клеток, но позволяет фиксировать мазок биологического субстрата на предметном стекле.

15-20 мин - это время, достаточное для прокрашивания фиксированного на стpелке материала.

5% - это нормативная цифра, установленная нами опытным путем при исследовании РОЭ у здоровых детей.

Примеры конкретного выполнения способа касаются здоровых детей и больных ОРВИ и больных аллергическими заболеваниями (крапивница, бронхиальная астма, аллергический ринит, экссудативно-катаральный диатез, аллергические стенозы гортани).

П р и м е р 1. Трушков А. 4 года, ребенок посещает д/с, практически здоров. Способ осуществляли при разных условиях: результаты осуществления предлагаемого способа с использованием 0,5% взвеси бараньих эритроцитов, сенсибилизированных гистамином, инкубации длительностью 15 мин при 37^оС, фиксации в парах формалина 5 мин, фиксации 15 мин в 96^о-ном этиловом спирте и окраске по Романовскому-Гимзе в течение 15 мин приведены в табл.1.

Результаты проведения предлагаемого способа с использованием 0,5% взвеси бараньих эритроцитов, сенсибилизированных гистамином, инкубации длительностью 20 мин при 37,5^оС, фиксации в парах формалина 7 мин, фиксации 20 мин в 96^о-ном этиловом спирте и окраске по Романовскому-Гимзе в течение 20 мин представлены в табл.1.

Достоверность отличий > 0,05.

Вывод: аллергического состояния не выявлено.

Диагноз: практически здоров.

П р и м е р 2. Мошкин Н., 4 года, ребенок посещает д/с, практически здоров. Способ осуществляли при разных условиях: результаты предлагаемого способа с использованием 0,5% взвеси сенсибилизированных гистамином бараньих эритроцитов, инкубации длительностью 15 мин при 37^оС, фиксации в парах формалина 5 мин, фиксации 15 мин в 96^о-ном этиловом спирте и окраске в течение 15 мин приведены в табл.2. Результаты предлагаемого способа с использованием 0,5% взвеси бараньих эритроцитов, сенсибилизированных гистамином, инкубации длительностью 20 мин при 37,5^оС, фиксации в парах формалина 7 мин, фиксации 20 мин в 96^о-ном этиловом спирте и окраске в течение 20 мин представлены в табл.2.

Достоверность отличий > 0,05.

Вывод: аллергического состояния не выявлено.

Диагноз: здоров.

П р и м е р 3. Сазыкин А. 4 года, посещает д/с, практически здоров. Способ осуществляли при разных условиях: результаты предлагаемого способа с использованием 0,5% взвеси эритроцитов барана, сенсибилизированных гистамином, инкубации в термостате длительностью 17 мин при 37,3^оС, фиксации в парах формалина 7 мин и в этиловом спирте 17 мин, окраске по Романовскому-Гимзе в течение 17 мин приведены в табл.3.

Результаты предлагаемого способа с использованием 0,5% взвеси эритроцитов барана, сенсибилизированных гистамином, с инкубацией в термостате при 37^оС длительностью 20 мин, с фиксацией в парах формалина 5 мин и 15 мин - в 96^о-ном этиловом спирте, окраской по Романовскому-Гимзе в течение 30 мин приведены в табл.3.

Достоверность отличий > 0,05.

Вывод: аллергического состояния не выявлено.

Диагноз: здоров.

П р и м е р 4. Шафран С. 6 лет. У ребенка почти постоянно слизистые выделения из носа, периодически чихание, зуд. Общее самочувствие не страдает, температура тела 36,6^оС, по внутренним органам патология не определяется, в анализе крови эозинофилы 273 в 1 мкл, общий IIgЕ сыворотки крови 160 КЕ/л (норма 45 КЕ/л), выявлены аллергенспецифических IgЕ-антитела к половине определяющихся аллергенов. При применении предлагаемого способа диагностики % РОЭ составил 74%. Диагноз - аллергич. ринит.

П р и м е р 5. Попонова Н. 8 лет. Типичные приступы удушья без признаков вирусной инфекции или пневмонии на фоне нормальной температуры у девочки отмечаются в течение трех лет, начались после рецидивирующего течения стенозов гортани, протекавших по первому (аллергическому) клиническому варианту. Аллергическая наследственность отягощена.

В крови эозинофилов 275 в 1 мкл, иммуноглобулин Е - 760 КЕ/л (норма 80,5 КЕ/л), аллергенспецифические IgЕ-антитела выявляются по всем аллергенам. Содержание РОЭ - 13%.

Диагноз: бронхиальная астма, атопическая.

П р и м е р 6. Печерская Маша, 1 год 10 мес. У девочки в анамнезе пищевая аллергия, кожные изменения в виде мокнутия, зуда, гиперемии усиливаются на молоко, рыбу, цитрусовые. В крови содержание эозинофилов составляет 420 в 1 мкл, общий IgЕ - 54 КЕ/о (норма - 8,0) аллергены выявляются к 57% от определившихся. При определении РОЭ - 90%. Диагноз: экссудативно-катаральный диатез.

П р и м е р 7. Лебедев С. 3 года 6 мес. Больной периодически дает повторные эпизоды стеноза гортани без повышения температуры и без катаральных явлений. Стенозы быстро купируются ингаляциями и антигистаминными средствами на фоне отвлекающей терапии.

Эозинофилы крови - 285 в 1 мкл, РОЭ - 50%.

Диагноз: аллергический стеноз гортани.

П р и м е р 8. Фуфачев М. 1 год 5 мес. У ребенка температура 38,5^оС, кашель, насморк, гиперемия зева, признаки общей интоксикации.

В крови эозинофилов 220 в 1 мкл, РОЭ - 5%.

Диагноз: аллергическое состояние не выявлено, ОРВИ.

Таким образом, результаты проведенных исследований показывают, что у больных с аллергическим генезом заболевания усилено розеткообразование эозинофилов носового секрета с сенсибилизированными гистамином эритроцитами барана, что может быть использовано как диагностический признак атопических аллергических заболеваний. Суммарные результаты применения предлагаемого способа проводятся в приложении к акту клинических испытаний.

Преимущества и положительный эффект способa:
позволяет оценить функциональную активность эозинофилов в носовом секрете, что дает возможность диагностировать даже клинически невыраженные формы аллергии, то есть предлагаемый способ диагностически более точен;
предлагаемый способ имеет конкретный диагностический критерий с цифровым выражением (5% РОЭ), что позволяет более точно оценить получаемые результаты;
способ позволяет отдифференцировать атопические аллергические и неаллергические эозинофилии в носовом секрете;
способ технически прост, безопасен, не связан со взятием крови;
применяя данный способ диагностики, удается подтвердить диагноз и установить атопическую аллергическую природу заболевания у 82,1% больных в сравнении с 31,6% случаев диагностики по выявлению эозинофилии в крови этих больных, что говорит о высокой диагностической эффективности предлагаемого способа и позволяет повысить число диагностических результатов в сравнении с иммуноглобулином Е на 7,1%.

Использование: в медицине, в частности в аллергологии. Сущность: на мазок из секрета слизистой носа наносят 0,5% взвесь эритроцитов барана, предварительно сенсибилизированных гистамином, инкубируют в течение 15 - 20 мин при температуре 37 - 37,5°С, фиксируют в течение 5 - 7 мин в парах формалина и в течение 15 - 20 мин в 96°-ном этиловом спирте, окрашивают мазок по Романовскому-Гимзе 15 - 20 мин, микроскопируют и при наличии в мазке более 5% розеткообразующих эозинофилов диагностируют атопическое аллергическое заболевание. Способ позволяет повысить точность диагностики. 3 табл.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АТОПИЧЕСКИХ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ путем определения содержания эозинофилов в мазке из секрета слизистой носа, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и специфичности способа, на мазок наносят 0,5% -ную взвесь эритроцитов барана, предварительно сенсибилизированных гистамином, инкубируют в течение 15 - 20 мин при 37 - 37,5^oС, фиксируют в течение 5 - 7 мин в парах формалина и в течение 15 - 20 мин в 96-градусном этиловом спирте, окрашивают мазок по Романовскому-Гимзе 15 - 20 мин, микроскопируют и при наличие в мазке более 5% розеткообразующих эозинофилов диагностируют атопическое аллергическое заболевание.