Способ получения монослоя эритроцитов для иммунологических исследований Советский патент 1992 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии.

Наиболее близким техническим решением, к изобретению является способ ис- пользования 2,5-и опека-донатора аминогрупп для аминирооания стекла.

На обезжиренную стеклянную поверхность чашек типа Орион наносят 2,5%- ный водный раствор 2,5-ионена с ФЗФ (рН 7,4) в количестве 4 мл на одну чашку. Экспозиция с целью электростатического прикрепления поликатиона к стеклу составляет 2 ч при комнатной температуре. После экспозиции поликатион сливают, чашки отмывают ФЗФ без поликатиона и наносят на них 4%-ную взвесь отмытых эритроцитов в ФЗФ. Экспозиция прикрепления эритроцитов составляет 45 мин при комнатной температуре. После экспозиции оритроци- тэрной взаеси чашки тщательно отмывают

для удаления неадгезированных эритроцитов.

Полученный монослой используют согласно поставленной цели. Время получе ния монослоя составляет 3 ч. Прикрепление эритроцитов к стеклу происходит вследствие того, что суммарный заряд стекла является отрицательным, поликатион заряжен положмтельно, поверхность эритроцита суммарно заряжена отрицательно.

Однако в известном способе получения монослоя эритроцитов имеются существенные недостатки. Прикрепление эритроцитов к поверхности стекла недостаточно прочное, поскольку нанесение на поверх- Hocib стекла 2,5-ионсна предполагает образованно двух слоео электростатических связей: первый слой - отрицательно заряженные группировки стекла и положительно заряя елные группы 2,5-ионенэ, второй слол

О

00

,го to

- отрицательно заряженные группировки эритроцитов и положительно заряженные группы 2,5-ионена. Два слоя зарядов не обеспечивают прочность фиксации клетки к стеклу, поэтому для сохранения целостности монослоя требуется особая осторожность при отмывании его от эритроцитов буфером, особая осторожность при наслоении лимфоцитов на монослой и отмывание от непрекрепившихся лимфоцитов. Несмотря на это, добиться образования сплошного монослоя на 100% поверхности стекла все же не удается. Все это создает трудности работы с монослоем, увеличивает материальные и временные затраты на получение монослоя, превышающие обычные для этого метода 3 ч. В итоге трудоемкость получения монослол велика. Кроме того, стоимость препарата достаточно высока - для обработки одной чашки требуется реактив стоимостью около 25 долларов.

Цель изобретения - ускорение и улучшение качества целевого продукта.

Указанная цель достигается использованием в качестве донатора аминогрупп для получения положительно заряженной поверхности стекла у-амииопропилтриэток- сисилана.

Способ осуществляется следующим образом.

На тщательно обезжиренную стеклянную поверхность чашки Петри наносят 5-10 мл 2,5%-ного водного раствора у-амннопро- пилтриэтоксисилана. Чашку помещают в су- ховоздушный шкаф при 100°С на 15 мин. После прогревания раствору-аминопропил- триэтоксисилана сливают и он может Ьыть использован многократно. Чашку промывают тщательно дистиллированной водой и два раза ФЗФ (рН 7,2-7,4). На подготовленную тагам образом стеклянную поверхность наносят 4%-ную взвесь отмытых эритроцитов любого животного или человека. Обьем эритроцитарной взвеси составляет 4-10 мл.

Экспозиция для связывания эритроцитов составляет 5 мин. Неадгезированные эритроциты тщательно отмывают ФЗФ (рН 7,4). Полученный монослой эритроцитов готов к использованию в зависимости от поставленной цели. Время получения монослоя предлагаемым способом составляет 35-40 мин. Качество получаемого монослоя определяется под микроскопом при увеличении объектива в 200 раз (отмечается наличие свободно плавающих в растворе эритроцитов, непрерывность монослоя э полях зрения, Качество монослоя отмечается знаками:

0

5

0

5

0

-неудовлетворительный монослой (занимает 40% площади стекла, в полях зрения плавающие эритроциты).

+монослой занимает 80% площади стекла, в полях зрения плавающие эритроциты.

++монослей занимает 100% площади стекла, в полях зрения плавающие эритроциты отсутствуют,

Т-Аминопропилтриэтоксисилан используется для создания ковэлентно-за- крепленных аминогрупп на силаиольной поверхности (силохром, силикагель, пористое стекло и др.), что позволяет в дальнейшем использовать их как основу для модификации с целью иммобилизации бе/5 ко в.

Таким образом, у-аминопропилтриэ- токсисилан применяется для приготовления сорбентов на основе силохромовых матриц. Использование у-аминопропилтриэтокси- силана с целью получения монослоя клеток неизвестно.

Предложенное вещество обеспечивает модификацию стекла таким образом, что аминогруппы находятся в прочной ковален- тной связи с ним и в несколько раз большем количестве на единицу площади, Этим объясняется поочность прикрепления эритроцитов к стеклу, так как связь представляет собой не два слоя электростатических взаимодействий, а лишь один:

с т о к л о

э

р

и

т

р о

ц и

т

С целью отработки оптимальных режи- мов для получения эритроцитарного монослоя от морской свинки использовали 1; 2,5; 5; 10; 25%-ные водные растворы уами- нопропилтриэтоксисилана с целью амини- рования поверхности стекла. При этом концентрация эритроцитарной взвеси морской свинки оставалась постоянной.

В дальнейшем были использованы различные временные интервалы процесса аминировэния: 2, 5, 15 и 30 мин и темпера- тура 100и22°С.

Для определения длительности инкуби- рооания ОМС на аминированной поверхности стекла задавались временные интервалы: 5,10,20 и 45 мин при сохранении постоянства времени и температуры аминирования,

концентрации эритроцитарной взвеси и температуры инкубирования.

Таким образом, оптимальными режимами получения эритроцитарного монослоя на стеклянной поверхности являются использование 2,5%-ного водного раствора у-ами- нопропилтриэтоксисилана с целью аминирования стекла при 100°С в течение 15 мин с последующей отмыпкой и нанесением 4%-ной эритроцитарной взвеси при 22°С в течение 5 мин. Использование меньших концентраций и температур снижает качество монослоя, а повышение используемых концентраций приводит к непроизвольному расходу реактивов.

Предлагаемый способ получения монослоя эритроцитов может быть использован для выделения спонтанных розеткообразу- ющих лимфоцитов у крыс.

Известные способы выделения спонтанных РОК не позволяют получать их в неизменном виден в достаточном количестве.

Предлагаемый способ получения монослоя эритроцитов позволяет получать достаточное количество немодифицированных РОК крысы.

Пример. Лимфоциты тимуса, селезенки, лимфатических узлов брыжейки тонкой кишки, пеоиферической крови в концентрациях соответственно 5,3,3,2 10бкл/мл в объемах по 10 мл наслаивают на монослой эритроцитов, полученный предлагаемым способом. Инкубируют чашки Петри 30 мин при комнатной температуре, затем 1 ч при 4°С в присутствии 20%-ной декомплементи- рованной сыворотки морской свинки. Лим- фоцитарную взвесь сливают, чашки тщательно отмывают средой 199 от непрек- репившихся лимфоцитов к монослою, монослой лизируют 2 мл дистиллированной воды в течение 15 с, разводят избытком среды,

отмывают один раз этой же средой, ресус- пендируют клетки в объеме 1 мл этой же среды, подсчитывают снятые с монослоя лимфоциты в камере Горяевг. Подсчет ведут

в 100 больших квадратах камеры и производят перерасчет на 1 мкл.

Повторное розеткообразование с лимфоцитами, выделенными с монослоя эритроцитов, составило 95% РОК.

Таким образом, предлагаемый способ получения монослоя эритроцитов отличается от известного сокращением в 4,5 раза времени получения монослоя, снижением трудоемкости процесса. Способ позволяет

получать высокое качество монослоя эритроцитов, снимать с монослоя достаточное для использования число клеток лимфоид- ных органов, используя феномен розеткооб- разованич. Стоимость предлагаемого

реактива в 100 раз меньше, чем у известных способов (см. таблицу).

Анализ жизнеспособности клеток селезенки, снятых с эритроцитарного монослоя, определяемой с помощью 0,5%-ного раствора трипанового голубого, выявил 99% жизнеспособных лимфоцитов.

Формула изобретения Способ получения монослоя эритроцитов для иммунологических исследований путем покрытия поверхности стекла водным раствором аминирующего агента, его экспозиции и последующего нанесения на него взвеси эритроцитов, инкубации и отмывки, отличающийся тем, что, с целью ускорения и улучшения качества целевого продукта, в качестве аминирующего агента используют 2,5%-ный раствор У-эминопро- пилтриэтоксисилана, экспозицию осуществляют при температуре 100°С в течение 15 мин, а инкубацию эритроцитов - в течение 5-10 мин

Использование: изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано в клинической диагностике. Целью изобретения является ускорение и улучшение качества целевого продукта. Сущность изобретения заключается о обработке поверхности стекла годным раствором аминирующего агента, его эксплуатации и последующим нанесении на него взвеси эритроцитов, последующей инкубации и отмывки, причем в качестве амп- пирующего агента используют 2,5%-ныи растоор у-аминопропилтриэтоксисилзна, экспозицию осуществляют при температуре 100°С в течение 15 мин, а инкубацию .эритроцитов в течение 5-10 мин. Положитепь- ный эффект заключается в ускорении процесса в 4,5 раза с сохранением 09% жизнеспособных клеток. i I- т