Аналог энкефалина, обладающий анальгетической активностью Советский патент 1990 года по МПК C07K5/107 A61K38/07 C07K14/70 C07K7/06 A61K38/08 

Изобретение относится к новому биологически активному соединению аналогу энкефалина, обладающему анальгетической активностью, которое может найти применение в медицине. j

Цель изобретения - поиск в рбластиг .пептидов -аналогов энкефалина, обладающих более высокой анальгетической активностью, чем известным прирбдныа энкефапины или их синтетические аналоги.

Описьгеаемый аналог энкефалина син тезируют известными методами пептидной химии в растворе согласно приведенной на чертеже«схеме с использованием активированных эфиров трет-бутилоксикарбониламинокислот, fl -Амино00 ГО

;функцию D-орнитина защищают бензип оксикарбонильной группой, гидроксил тирозина - третбутилоксикарбошшьной

Kj Группой.

Для синтеза предпагаемого аналога

О) энкефалина используют аминокислоты и их производные фирмы Reanal (Венгрия). Все аминокислоты, кроме В орнитина, имеют L-конфигураци. Температуру . . плавления веществ определяли в капилляре (без коррекции). Индивидуальность промежуточных соединений контролировали с помощью тех на пластинKa«)Silufol UV254. (ЧССР).Дпя хроматографии аналогов энкефалина применяли стеклянные пластинки с закрепленным слоем силикагеля Silika Gel 60 I 31 F-254 фирмы Merk, (ФРГ). Испольэов . ли следующие системы растворителей хлороформ - этанол-уксусная кислота (АсОН), 85:10:5 (А), н-бутанол-пирйдин-АсОН-Ы О, 15:10:3:6 (В); ,15:12:3:10 (С); хлороформ - метанол АсОН - , 30:20:4:6 (Д) . Удельное оптическое вращение пептидов измеряют на поляриметре Perkin Elraer 14 М (ФРГ). Кислотный гидролиз про водят при 120°С в течение 24 ч. Аминокислотный состав определяют на ана лизаторе Jeol. Для всех соединений данные элементного анализа удовлетво рительно совпадают с вычисленным содержанием C,H,N. N-трет-бутилоксикарбонил-глицилфенилаланин (4). 6,6 г (40 ммоль) L-фенилаланина (2) растворяют в 40 мл 1 н. раствора гидроокиси натрия, добавляют 3,34 г бикарбоната натрия, 50 мл диметилформамида (ДМФА) и 16,94 г (40ммоль) пентахлорфенилового эфира трет-бутил оксикарбонил-глицина (3), растворенного в 20 мл ДМФА. Смесь перемешивают в течение нескольких часов. После завершения реакции (хроматографический контроль) реакционную массу разбавляют этилацетатом и водой (до раз деления слоев), охлаждают до и подкисляют 0,5 н. соляной кислотой до рН 3. Этилацетатный слой отделяют водную фазу экстрагируют повторно. Объединенный этилацетатный слой промывают водой, насыщенным раствором хлористого натрия и сушат над безводным сульфатом натрия. Кристаллический осадок полученный после отгон ки растворителя, перекристаллизовывают их этилацетата с небольшой доба кой петролейного эфира. Выход дипеп ида (4).- 11,4 г (88%), т.пл. 133135 С; 15,7 (с 1, ДМФА); Ri 0,73 (А), 0,80 (Д). N -трет-бутилоксикарбонил, бензилоксикарбонил-В-орнитил-глицилфенилаланин (7). 10,9 г (33,8 ммоль) дипептида (4 растворяют в 50 мл 70% раствора трифторуксусной кисуюты (TFA) в дихлорметане и выдерживают 30 мин. Растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром на фильтре и сушат в вакууме над гидроокисью калия. Получают 10,4 (91%) трифторацетата дипепти/ а (5), R. 0,63 (Д). 6 5,2 г (15,5 ммоль) трифторацетата (5) растворяют в 50 мл ДМФА, охлаждают до и при охлаждении добавляют 2,65 МП (15,5 ммоль) днизопропилэтиламина в 5 мл ДМФА и 8,2 г (15,5 ммоль) пентафторфенштового эфира N -трет-бутилоксикарбонил, N -бензшюксикарбонил-В-орнитина (6), растворенного в 15 мл ДМФА. Реационную массу перемешивают несколько часов и после завершения реакции обрабатывают аналогично соединению 4. Продукт, полученный после отгонки j растворителя, очищают на колонке с силикагелем фирмы Merck. .Элюирование проводят в системе: хлороформ этанол -этилацетат -АсОН - 285:5:8:2:0,25. Соответствующие фракции собирают, упаривают и сушат в вакууме. Получают 5,9 г (6,7%) масла защищенного трипептида (7) с Rf 0,65 (А). 0,72 (В). N,0-ди-трет-бутилоксикарбонш1-тирозш1-Н°-бензилоксикарбонил-В-орнитил-глицил-фенилаланин (10). 20.0г (35 ммоль) трипептида (7) растворяют в 100 мл 50% раствора TFA в дихлорметане и выдерживают в течение 20 мин. Растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром. Образовавшийся осадок отфильтровывают, вновь промывают эфиром и высушивают в вакууме над гидроокисью калия. Получают 19,2 г (94%) трифторацетата трипептида (8) с Rf 0,62 (Д). 18.1г (31 ммоль) трифторацетата трипептида (8) растворяют в 100 мл ДМФА, охлаждают до 0°С, добавляют при перемешивании 5,3 мл (31 ммоль) диизопропилзтиламина в 10 мп ДМФА и 16,6 г (31 ммоль) пентафторфенилового эфира К,0-ди-Вос-Ь-тирозина (9). Реакционную массу перемешивают I,5-2 ч (хроматографический контроль) и после завершения реакции обрабатывают аналогично соединению (4). Продукт, полученный после отгона этилацетата, размешивают с эфиром и охлаждают. Выпавший осадок отфильтровывают,промывают эфиром и сушат в эксикаторе. Выход 16,0 г (63%) защищенного тетрапептида (11) с Rf 0,75 (А), 0,55 (В, Merck); loiT + 5,6° (с I, ДМФА). N-0-ди-трет-бутилоксикарбонил-тиро-и знл-Ы-(Ы-бензш1оксикарбониласпарагинил)-D-орнитил-глицил-фенилаланин (12). В 18 г (22 ммоль) защищенного тет рапептида (9) в 150 мл метанола, 15 МП АсОН и 20 мл добавляют пал ладиевую чернь и гидрируют в течение нескольких часов. Катализатор отфиль ровывают, фильтрат упаривают. Остаток растирают с эфиром и фильтруют, затем дважды переосаждают из спирта эфиром, вновь промывают эфиром и сушат в вакууме над гидроокисью калия. Получают 13,8 г (91%) тетрапептида (11) с Rf 0,15 (А), 0,72 (Д, Merck), 0,77 (С, Merck), 5,1 г (6,8 ммоль) тетрапептида (1 растворяют в 100 мл ДМФА и при перемешивании и охлаждении добавляют 1,16 мл (6,8 ммоль) диизопропилэтил. амина в 3 мл ДМФА и 3,3 г (6,8 ммоль нитрофенилового эфира N-бензилоксикарбонил-1-аспарагина, растворенного в 15 МП ДМФА. Через 2-3 ч реакционную массу обрабатывают аналогично со единению (4). Продукт, послученный после отгонки растворителя, очищают на колонке с силикагелем фирмы Merek. Элюирование проводят в системе; хлороформ -этанол - этиладетат - AcOH-Hj 0, 185:5:8:2:0,25. Соответствующие фракции собирают, упаривают и сушат в вакууме. Получают 4,6 г (70%) разветвленного пентапептида эн кефалина (12) с oi + 8, (с 1, ДМФА); Rf 0,72 (А), 0,83 (Д). N,О-ди-трет-бутилоксикарбонилтирозил-М -(три-бензилоксикарбонил- .аргинил-аспарагинил)-В-орнитш1-глицил-фенилаланин(14). Из 2 г (2,28 ммоль) пентапептида (12) и 1,69 г (2,28 ммоль) пентафторфенилового эфира три-бензилоксикарбонил- 1 -аргинина получают гексапептид (14) аналогично соединению (12 Очистка продукта, полученного после отгона растворителя, не проводится ввиду плохой растворимости полученно го соединения. й)Псод 2,7 г (87%) защищенного гексапептида (14). Тирозш1-К°-(аргинил-аспарагинил)-В орнитил-глицилфенилаланин (1). К Ю,6 г (0,44 мйоль) защищенного гексапептида (14) в 20 мл метанола, 2 мл АсОН и 0,5 МП Hj,0 добавляют палладиевую чернь и гидрируют в течение 2-3 ч. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растирают с эфиром и сушат в вакууме над гид роокисью калия. Полученный продукт растворяют в 5 МП 70% раствора WA в хлористом метилене и выдерживают 30 мин. Растворитель отгоняют и остаток растирают с эфиром. Образовавшийся осадок отфильтровывают, повторно промывают эфиром и сушат в вакууме. Полученный продукт очищают высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке ZorbaxC. Элюирование осуществляют смесью этанол - 0,1 М раствор ацетата аммония, 5:95. Соответствующие фракции собирают и лиофилизуют. Выход 220 мг (42%) разветвленного гексапептида энкефапина (I) с + 33 (с, I; 0,2 н. АсОН); Rf 0,32 (В, Merck), 0,16 (Д, Merck)} аминокислотный состав: Туг 0,86; Gly 1,00; Phe 0,92; Orn 0,93; Asn 0,98 Arg 0,79. Биологическую активнось описываемого аналога энкефалина (1) исследуют в опытах in viyo. Анальгетический эффект соединения (1) сравнивают с таковым морфина, природного энкеФалина и с известным аналогом энкефалина (по данным литературы). Анальгетическую активность определяют по методу H.Ueda etal. Опыты проводят на беспородных мьшгах-самцах массой 18-22 г. Исследуемые вещества, растворенные в стерильном физиологи-, ческом растворе, вводят при помощи 1-образной иглы в asteana magna мозга неанестезированным мьшгам в количестве 10 мкл. Исследован диапазон доз от 0,025 до 1,0 мкг на животное. Контрольным животным вводят 10 мкл стерильного физиологического раствора. При внутривенном введении препарат вводят в хвостовую вену мьш1ей в диапазоне доз от 25 до 50 мг/кг. Каждая экспериментальная группа состояла из 10 мьшей. Анальгетический эффект соединений оценивают по тесту tail pinch при помощи артериального зажима, который накладывают на основание хвоста. Определение болевой реакции проводят через 5,15,30,60,90 мин после введения и затем каждые 30 мня до исчезновения болевой реакции. Результаты выражают альтернативным методом в проценте мышей, показавших анальгетическую реакцию. При вычислении Rg использован метод итчфшвда и Уилкоксона. Анальгетичес- ая активность и продолжительность ействия соединений приведены в табице. 7 Как видно из таблицы, описываемый аналог энкефалина (1) является высокоактивным анальгетиком. Он в 24 раз активнее морфина и в 4 раза превосхо дит по активности соединение - его близкий структурый аналог. Туг-DOrn- Gly-Phe-NHi Pro- хотя и уступает ему по продолжительности действия (30 и 90 соответствен но) . Недостаточная продолжительность действия описываемого соединения ком пенсируется более высо.ким значением .терапевтического индекса, что характеризует описываемое соединение как высокоактивное и малотоксичное.

Анальгетическая активность аналогов энкефалина 6 8 Сравнение ЕД gp соединений (О и его аналога при внутривенном введении действительно показывает, что соединение (1) немного уступает аналогу, однако рассмотрение доверительных интервалов (25-50) и 17-40 мкмоль/кг указывает на то, что эти соединения при таком пути введения практически одинаково - активны и действуют достаточно продолжительное время (продолжительность их действия равна продолжительности действия морфина). Описываемое соединение (1) значительно менее токсично ( при внутривенном введении), чем его аналог (ТИ 12,5 при внутривенном введении). По совокупности свойства описываемое соединение имеет преимущества перед известными ранее аналогами энкефалина.

Аналог энкефалина формулы Tyr-DOrn-Gly-Phe .Arg-Asn-J обладающий анальгетнческой активностью. (Л

Tyr-DOrn-Gly-Phe 0,05 30 Arg-Aen-J (0,03-0,10)

Tyt-t)brn-eiy-Phe-NH O,2 90 Pro -.- (0,09-0,4) Мее-эпкефалхя ISA IS

(90-261)

,2 60

(0,6-2,2)

5i

60 60

18 12,5

3S

(25-50) 26

69

(17-W) He девствует внутривеяно

100

60

1 18

(15-22)

Arg- Asa