Способ получения трипептидов Советский патент 1984 года по МПК C07K5/87 A61K38/06 C07K1/08 C07K5/97 

Изобретение относится к способу получения новых трипептидов - биологичсски активных соединений, котоPL.1C могут найти применение в медицине,

В пептидной химии широко используют способ получения пептидов путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с С-концевой аминокислоты с помощью активированных эфиров М -защищенных аминокислот, например, пентафторфенщзовых эфиров l .

Цель изобретения - получение новых трипептидов, обладающих ценными фа рмакологическими свойствами. Поставленная цель достигается способом получения трипептидов общей формулы

X-y-W-NHj, (I) где X -L -пироглутамил,D -пироглутамил, L-б-кетопипеколил, 1кетоимидазолидин-4-карбонилL-тиазолидин-4-карбонил} У - L-норвалил,L -лейцил; W - U -пролил , Т -пролил , L -изолейцил, L -гомопролил,L -пипеколил , L-тиазолидин-4-карбонил,

заключающимся в том, что амид аминокислоты общей формулы

H-VJ-NH,(Ц)

где W - имеет указанные значения ацлируют пентафторфениловым эфиром W-трет бутилоксикарбониламинокислот общей формулы

Вос-У-ОР{р, (111 где Вое - трет бутилоксикарбонил} Pfp - пентафторфенил; У - имеет указанные значения, из полученного защищенного дипептида общей формулы:

Boc-y-W- NH, , W где Вое, У и W - имеют указанные знчения,

путем Ьцилолиза получают свободный дипептид общей .формулы

H-y-W-NHj, . (V) где У и W - имеют указанные значения,

который ацилируют пентафторфениловым эфиром N -бензилоксикарбониламинокислоты общей формулы

Z -X-OPfp, (VI) где Z - бензилоксикарбонилf X и Pfpимеют указанные значения, до получения защищенного трипептида общей формулы

г;-х-у-у/-Ш2 Cvu)

где Z ,Х, У и А/ имеют указанные значения,

из которого путем каталитического гидрирования удаляют N-концевую заЧитную группу.. .

В примерах, поясняющих практическое выполнение предлагаемого способа получения трипептидов, использованы следующие сокращени-я:

- L-гомопролин;

, НРго Kic

-Ь-2-кетоимидазапкдин-4карбоновая кислота;

-L-б-кетопиперидин-2-карКрс

боновая кислота;

Pi р - ui-пипеколиновая кислота; Tea -L -тиазолидин-4-карбоновая кислота;

ДЦГК

-дициклогексилкарбодиимид ДЦН

-дициклогексилмочевина;

Pf р-ОН - пентафторфенол; ДМФА - диметилформамид. Оптическое вращение измеряют с пмощью поляриметра Perkin-Elmer 141

Тонкослойную хроматографию проводят на пластинках Kieselgel G nach Stahl фирмы Merck ФРГ в следующих системах растворителей:

1.Хлороформ:метанол - 9:1.

2.Этиладетат:(пиридин:уксусная кислота: вода - 20:6:11) - 95:5.

3.Этилацетат:(пиридин: уксусная кислота: вода - 20:6:11 - 9:1.

4.Этилацетат: пиридин:уксусная кислота:вода - 20:6:11) - 8:2.

5.Этилацетат: (пиридин:уксусная кислота: вода - 20:6:11) -3:2.

6.Этилацетат: (пиридин:уксусная кислота:вода - 20:6:11) - 2:3.

Пятна на хроматограг/1мах детектируют с помощью раствора нингидрина с последующим выдерживанием в течение 5 мин при 105°С к раствором толидин-йодистый калий после предварительной обработки газообразным хлором.

Очистку конечных соединений осуществл:яют с помощью колоночной хроматографии с использованием в качесве сорбента Силикагеля 6 фирмы Merck (ФРГ) с величиной частиц 0,062 - 0,2 им.

Пример 1. Амид L -пироглутамил-L-л ей.цил-Ь-пипекол и новой кислоты.

стадия 1 Хлоргидрат амида L -лейцил-Ь пипеколиновой кислоты. 1,54 г (12 ммоль) H-P,-i P-WH2 суспендируют в 20 мл ДМФА, добавляют 5,16 г (13 ммоль) Boc-LeuOPfp, 1,68 мл (12 ммоль). триэтиламина при перемешивании. Полученный раствор упаривают в вакууме и полученное в ос.татке масло растворяют в 60 мл хлороформа. Раствор смешивают с 0,2 глл 2-(диметиламино)-этиламина, через 5 мин промывают 1 и. раствором соляной кислоты (3 раза по 20 мл) , 1 и. раствором бикарбоната натрия (3 раза.по 20 мл) и водой (З раза по 20 мл) , сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают Остаток растворяют в 3 мл этилацетата и смешивают раствор с 10 мл 5 н. раствора соляной кислоты в этиацетате. Через 1 ч реакционную смес разбавляют эфиром, выпавший .осадок отфильтровывают и сушат в вакууме над безводным сульфатом натрия. В итоге получают 3,12 г (94%) H-Leu-Pip-NHjHCl. ,46 (5). Аминокислотный анализ. С Си 0,95 (1,011; Leu 1,0 СЬОЬ 0,95 (1 элементный анализ. Рассчитано,%: С 15,90; Н 8,01; N15,90. CJ HjgOa N (мол .вес 352,44У Найдено,%: С 57,77; Н 8,20; N 15,83. Стадия 2. Амид бензилоксикарбонил-1-пироглутамилЧ.-лейцил-1,-пипеколиновой кислоты. . 3,13 г (11,2 ммоль H-Leu-Pi p-MHg и 4,94 г ((11,5 ммопь) Z -Се,р-ОР{р р творяют в 35 МП ДНФА и раствор сме шивают с 1,57 мл (11,2 мглоль)) триэтиламина. Реакционную смесь перем шивают 5 MHHj добавляют 1,57 мл (11,2 ммоль) триэтиламина, перемешивают в течение 20 мин и упариваю в вакууме. Остаток растворяют в 50 мл хлороформа и раствор промыва ют 1 Н. раствором соляной кислоты (2 раза по 30 мл), 1 н. раствором бикарбоната натрия (з раза по 30 м и 30 мл воды. Органическую фазу высуш ют над безводным сульфатом натрия уйаривают. Аморфный остаток nepeT-ie шивают с холодным эфиром, эфир декантируют и оставшееся масло внося в н-гексан до затвердения. Получен ный таким образом аморфньй продукт (4,7 г)кристаллизуют из смеси этил ацетат - эфир. Получают 3,32 г (б1 Z-CEp-LeO-.Pip-(4H2. Т.гш. 143-144°С ,51 (4) ,Lot р -97,2° , АсОН) Элементный анализ Рассчитано,%: С 61,71 } Н 7,04; N11,51. ,N4 (мол,вес 486 ,.57) Найдено,%: С 61,67; Н 7,05; N 11,40. Стадия 3. Амид L-пироглутамил-Ь лейцил-1-пипеколиновой кислоты. 2,1 г (4,32 ммоль) Z-CEp-Leu-p pNH растворяют в 40 мл метанола, добавляют 0,2 г 10%-ного палладия на активированном угле в качестве катализатора и пропускают в реакци онную смесь газообразный водород в течение 1 ч. Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат упариваю остаток растирают с эфиром. Полученный таким образом сырой продукт (1,48 г) растворяют в 2 мп воды, осветляют активированным углем и отфильтровывают. В фильтрате растворяют 4 г хлористого натрия и раствор промывают хлороформом (з раза по 10 мл). Органическую фазу в сушивают над безводным сульфатом натрия, упаривают и аморфный осадок растирают со смесью.этилацетатд и эфира. В итоге, получают 1,33 г (87,5%Кб P-Leu-P(,-p-NH7. ,60 (5), ,4 (С 1. АСОН) . Элементный анализ. Рассчитано,%: С 57,94, Н 8,01, W 15,90. CijH- N O (..юл.вес 352,44) Найдено,%: С 57,77, Н,8,20 Н 15,83. Аминокислотный анализ. Сби 0,95 1,01-, Leli 1,0(1,0) , 0,95 (1,0). Пример 2. Амид L -пироглутамил- 1-лейцил-1.-тиазолидин-4-карбонов й кислоты. Стадия 1. Хлоргидрат амида i лейцил-1-тиазолидин-4-карбоновойкислоты. 1,81 г (11 ммоль) H-Tca-NHgHCP суспендируют в 30 мл ДМФА и смешивают с 3,97 г (10 ммоль) Boc-Leu-OP4p, 1,49 г (11 ммоль) 1-окси-бензтриазола и 1,22 Nui (11 ммоль) W -метилморфолина. Полученный раствор отстаивают в течение ночи при комнатной темпетратуре, затем упаривают в вакууме и остаток растворяют в 80 мл хлороформа. Раствор промывают 1 н,. раствором соляной кислоты (з раза по 20 мл), 1 н. раствором карбоната натрия (з раза по 20 мп) и 10 мп. воды, .высушивают над безводным сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Хлопьевидный аморфный остаток растворяют в 5 мл этилацетата, смешивают с 10 мл 7 н. раствора соляной кислоты и этилацетата. Через 1 ч реакционную смесь разбавляют эфиром полученный осадок отфильтровывают и высушивают в вакууме над безводной гидроокисью натрия. В итоге получают 1,84 г (б5%) H-Leu-Tca-NH.jx кисе. ,25 (5), Т.пл. 170-174°С (разл) . Стадия 2. Амид бензилоксикарбонилL-пироглутамнл-Ь-лейцил-Ь-тиазолидин-4-карбоновой кислоты. 1,69 г (6 1Моль)Н-1ец-Тса-КН2-НСЕ суспендируют в 20 мл ДМФА и смешивают с 2,7 г (6,3 ммоль) Z -cEp-OPfp и 0,84 мл (б ммоль) триэтиламина. Смесь перемешивают в течение 20 мин при комнатной температуре, затем упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 50 мл хлороформа и раствор промывают 1 н. раствором соляной кислоты (з раза по 10 мл), 1 н. раствором бикарбоната натрия (З раза по 10 мл); и 10 мл воды. Органическую фазу упаривают, остаток растирают с эфиром и полученный сырой продукт очищают многократным осаждением из смеси этилацетат - эфир. Получают 1,64 г (56%-)Z -CEp-Leu-HH . Т.пл. 108-110°С, ,46 (.4) ,ailD -130,30 (, АсОНЬ

Стлдия 3. Лмид L-пнроглутамил.г:: 1 иил-1-тиа1Олидин-4-карбоновой кислоты,

1,62 г (з,3 ммоль) Т: -Cfp-Leu-TcaHtlj растворяют в 6 мл ох.пажденного льдом 3,5 н. раствора бромистого всздорода в ледяной уксусной кислоте. Раствор отстаивают в течение 1,5 ч при О - 5°С. Затем реакционную смесь разбавляют эфиром, верхнюю фазу декантируют и оставшееся масло растворяют в 20 N воды. Водный раствор нейтрализуют твердым бикарбонатом натрия и экстрагируют эфиром (З раза по 10 мл) . Водную фазу упаривают в вакууме, остаток растворяют в 20 мл хлороформа, раствор высушивают безводным сульфатом натрия и упаривают. Аморфный остаток растирают с эфиром и высушивают. Полученный сырой продукт (1,13 г) растворяют в элюирующей жидкости (4), вводят в колонку, заполненную 20 г силикагеля. Колонку элюируют той же самой смесью растворителей. Из фракции, содержащей сырой продукт, выделяют 0,78 г аморфного продукта. Этот продукт растворяют в 20 МП воды, раствор осветляют активированным углем и лиофилизуют. Получают 0,62 г СЕрLeu-Tca-NH (53% от теории). Щ 0,53 (.5) ,,0 (, АсОН)

Аминокислотный анализ. СВи 0,94 (1,0); Leu 1,0 (1,01 .

Пример 3. Амид L -пироглутамил-1-лейцил-Т)-пролина.

Стадия 1. Хлоргидрат амида: -L лейцил-Т}-прол ина.

0,91 г (8 ммоль) H-D-Pro-NH и 3,2 (8 ммоль) Boc-Leu-Opfр растворяют в 30 МП ДМФА, смешивают с 1,12 мл (в ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь выдерживают в течение ночи и упаривают. Остаток растворяют в 60 мл хлороформа, раствор промывают 1 н. соляной кислотой (2 раза по 20 мл) , 1 н. раствором гидроокиси натрия (З раза по 20 мл и 20 МП воды, сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают. Остаток растворяют в 5 мп этилацетата, смешивают с 7 мл 4 н. раствора хлористого водорода в этилацетате. Реакционную смесь через 1 ч разбавляют эфиром, образовавшийся осадок отфильтровывают и сушат в вакууме над безводной гидроокисью натрия. В итоге получают 1,54 г (73%) H-Ley-Pr o-NH2HCe.

Стадия 2. Амид бензилоксикарбонил-L-пиpoглyтaмил-L-лeйцил-D-пpoлина.

1,54 г (5,8 ммоль) H-L,eu- -Pro -ЦН.HCt растворяют в 20 мл ДМФА, смешивают с 0,81 мл (5,8 ммоль) триэтиламина и 2,58 г (б ммоль)

Z -С р-ОР1р. Реакционную смесь перемешивают 5 мин, добавляют 0,81 мл (5,8 ммоль) триэтиламина, перемешивают 10 мин и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 60 мл хлороформа, раствор промывают 1 н. раствором соляной кислоты (з раза по 15 глп 1 н. раствором гидроокиси натрия (3 раза по15мл)и15мл воды, высушивают над безводным сульфатом

натрия и упаривают. Аморфнчй остаток растирают с эфиром. Полученный сырой продукт (2,1 г)перекристаллизовывают из 5 мл этилацетата. В итоге получают 1,8 г (66%) Z - CEp-Leu-D5 Pro-MHj. Т.пл. 153-157°С, ,38 U) ,,5°С (С 1, АСОН).

Стадия 3. Амид L-пироглутамилL, -лейцил-В-пролин. 1,5 т(3,25 ммоль) 2 -Cf,P-beu-B-Pf-o0 1 растворяют в 70 мл метанола, раствор смешивают с 0,3 г 10%-ного палладия на активированном угле в качестве катализатора и пропускают через раствор водород в те5 чение 1 ч, отфильтровывают катализатор, фильтрат упаривают и аморфный остаток смешивают с эфиром. Полученный сырой продукт 0,94 г растворяют в воде, раствор осветляQ ют активированным углем и отфильтровывают, фильтрат лиофилизуют. Получают 0,87 г (79%lce p-Leu-D-Pt-o - . NHg. ,47 (5),40(, АсОн),

Аминокислотный анализ. CEul,02 (1,0) ; L ей 1,0 .(1,0) V Pro 0,96(1,0).

5 .

Пример 4. Амид L-пироглутамил-Ь-норвалил-Ь-изолейцина.

Стадия 1. Амид трет-бутилоксикарбонил-L -норвалил-1-изолейцина.

3,7 г (19 ммоль) H-IEe-NHjHCe

растворяют в 30 мл ДМФА, добавляют при перемешивании 2,7 мл (18 ммоль) триэтиламина и 6,63 г (17,3 ммоль) Boc-Nva-OPlp и через 5 мин добавляют 2,4 мл- (17,3 ммоль) три этил амин а. Через iO мин реакционную смесь упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 100 мл хлороформа, раствор промывают с 1 н. раствором соляной кислоты (2 раза

0 по 20 мл), 1 н. раствором карбоната Нс1трия (2 раза по 20 мл) и 20 мл воды, высушивают над безводным сульфатом натрия и упаривают. Кристаллический остаток растворяют с эфиром

5 и высушивают. В итоге получают 4,7 г

(83%) Boc-Nva-3 e-NH. Т.пл. 192 1940с, ,60 (2) ,,7 (, метанол).

Стадия 2. Хлоргидрат амидаL -нор0 вапил-Ь-изолейдина.

4,5 г (13,7 ммоль) Boc-Mva- jee-WHg суспендируют в 20 мп этилацетата и смешивают с 12 мл 6 н. раствора соляной кислоты в этилацетате, через

5 1 ч разбавляют эфиром, осадок отделяют фильтрованием и оырой продукт (3,6 г)перекристаллизовывают из смеси метанола и эфира. Получают 3,5 г (96%) H-Nve-JEe-NH-. нее . Т.пл. 254-255 С, ,45 (5), ,8 (, метанол). Стадия 3. Амид бензилоксикарбонил-Ь-пироглутамил-1-норвапил-Ьизолейиина. 3,3 г (l2,4 ммоль) H-Nva-TCe-NH -HCE растворяют в 40 МП ДМФА. К раствору при перемешивании добавляют 1,74 мл (12,4 ммоль) триэтиламида и 5,85 г (l3,6 ммоль 2-С6р-ОР{р. Через 5 ми добавляют 1,74 мл (12,4 ммоль три этиламина. Реакционную смесь разбавляют эфиром, перемешивают, остав ляют стоять в течение 2- ч в холодильнике и затем отфильтровывают. В , получают 5,11 г (86%) 7. Муа-Зее-ИН.Т.пл.252-253°С, R,0,6 (.4Г;1ЫЗ -57,, АСОН). Стадия 4, АмидL -пироглутамил-L норвалил-1-изалейцина. 4,75 г (10 ммоль) Z-Gtp-Nva-lEeVJH2 растворяют в 200 мл -уксусной кислоты и после добавления 1 г 10% ного палладия на активированном уг ле в качестве катализатора в течение 1 ч пропускают через раствор газообразный водород. По окончании гидрирования катализатор отделяют фильтрованием, фильтрат упаривают остаток растирают с эфиром. Получа 3,34 г (98%)Cep-Nva-1 e-NHtJl98% от теории). Т.пл. 267-270° (разл.) , ,61 (5) ,Mi -50,2 (, АсОН) Аминокислотный анализ. CSu 0,94 (1,0); Nv а 1,0 (1,0,ЧЕе 1,05 (l, Элементный анализ. Рассчитано,%: С 56,45 Н 8,29; «16,46. |Ь Н-гвО N,} (моль.вес 340,43) Найдено,%: С 56,56; Н 8,37; «16,28. Пример 5. АмидL -тиазолидин-4-карбонил-Ь-лейцил-и-пролина. Стадия 1. 5Слоргидрат амида L -л цил-Ь-пролина. ,28 г (20 ммоль) H-Pho-NH и 3,97 (10 ммоль) Boc-L ell-ОР{р растворяют в 40 мл ДМФА и через 5 мин раствор упаривают в вакууме. Остаток раство ряют в 80 мл хлороформа, раствор промывают 1 и. соляной кислотой (З раза по 20 мл), 1 н. раствором бикарбоната натрия (З раза по 20 мл и 20 мл воды, сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают. Остаток растворяют в 5 мл этилацетата, раствор смешивают с 10 мл 5 н, раствора хлористого водорода в этилацетате. Через 50 мин реакционную смесь разбавляют с эфиром, образовавшийся осадок отфильтровыBcUOT и сушат в вакууме нгщ безводноЛ гидроокисью натрия, В итоге получают 2,42 г (,91 г) H-L о -14-o-Nil,, X нее R 0 ,20 (П . Стадия 2. Амид тн 1:1Олидии-4-ка}-бо НИЛ - L -л ей цил - L - прол и и а . 5,13 г (22 ммоль) Вос-Тса-ОМ и 4,0S г (22 ммоль) P.ipOH растворяют в 60 мп этилацетата н раствор при охлаждении льдом и перемешивании смешивают с 4,12 г (20 ммоль) ДЦГК. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при 0-5 С, затем отфильтровывают ДЦМ, фильтрат и остаток растворяют в 50 мл Н-гексана. Раствор промывают 1 н . раствором бикарбо-ната натрия (Б раз по 25 мл)и 25 мл воды, высушивают над безводным сульфатом натрия и упаривают. Полученное таким образом 7,32 г Boc-Tca-OPip растворяют в 20 мл ДМФА и раствор добавляют к суспензии 5,23 г (20 ммоль) H-Leu-Pro-МНо- НСС в 30 мл ДМФА. Затем эту сМесь охлаждают льдом и при перемешивании добавляют 2,8 г (20 ммоль) триэтила мина. Через 5 мин добавляют 2,8 (20 ммоль) триэтиламина, перемешивают 20 мин и упаривают в вакууме. Полученное в остатке масло растворяют в 100 мл хлороформа, раствор промывают 1 н. соляной кислотой (3 раза по 30 мл) 1 н. раствором бикарбоната натрия (3 раза по 30 мл) и 30 мп воды, су- шат над безводным сульфатом натрия и упаривают. Полученный в остатке 8,84 г Boc-Tca-Leu-P o-NH2 растворяют в 15 мл этилацетата, раствор смешивают с 15 мл 6 н. раствора соляной кислоты в этилацетате и через 1 ч разбавляют этилацетатом. Полученный осадок растирают, отфильтровывают и высушивают в вакууме над бе-зводным едким натром. Таким образом получают 8,05 г сырого продукта, который растворяют в 80 мл воды, раствор экстрагируют эфиром (З раза по 20 мл) , затем значения рН водного раствора устанавливают на значении 8 и раствор экстрагируют хлороформом (3 раза по 20 мл). Объединенные экстракты хлороформа высушивают над безводным сульфатом натрия и упаривают. Остаток растирают с эфиром и высушивают. В итоге получают 5,20 г (76%) Н-Тсаг Leц-P o-NH, . Т.пл. 159-ieo C, R{ 0,63 (5) ,LDi,;)j,-162,9°(, АсОН). Аминокислотный анализ. Ueul,0 1,0); Pro 0,95 (1,0). Элементный анализ. Рассчитано,%: С 52,61, Н 7,65; 16,36; N 9,36. (мол..вес 342,46). Найдено,%: С 52,45; Н 8,03; 16,51; Ч 9,59. Пример 6. Амид 1-2-кетоимидазолидин-4-карбонил-Ь-лейцил-Ьпролина.

Стадия 1. Пентафторфениловый эфи бензилоксикарбонил-Ь-2-кетоимидазалидин-4-карбоновой кислоты. 10,56 г (40 ммоль) Z-Ktc-OH и 9,09 (44 ммопь) Р р-ОН растворяют в смеси 100 мл (.1:2) смеси ДМФА и диоксана (1:2). Рставор при охлаждении льдом и перембаиивании смешивают с 9,06 г (44 ммоль) ДЦГК. Реакционную смесь перемешивают при О,5°С в течение 1,5 ч, затем отфильтровывают ДЦМ, фильтрат упаривают и полученное в остатке масло смешивают в Ц-гексаном для кристаллизации. Полученный сырой продукт (16,46 г) перекристаллизовывают из 50 мл этил ацетата. Получают 12,75 г (. - Клс-OPip. Т.пл. 146-148 с, ,53 (1) -, ot 2,- -42,1 (, этилацетат) .

Элементный анализ.

Рассчитано,%: С 50,25, Н 2,58, VI 6,51, F 22,08.

C;,g Н, F NjO (мол. вес 430,29)

Найдено,%: .С 49,88, Н 2,35, W 6,66; F 21,81.

Стадия 2. Амид бензилоксикарбонил-1-2-кетоимидазолидин-4-карбонил-1-лейцил-Ь-пролина. 2,38 г (9 ммоль) H-Leu-PtO-WHjНСЕ суспендируют в 30 мл ДМФА и смешивают с 3,87 г (9 ммоль) --КА c OPfpи 1,26 мл (9 ммоль) триэтиламина, перемешивают 5 мин и добавляют 1,26 мл(9 ммоль) триэтиламина, перемешивают 20 мин и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 50 мл хло реформа, раствор промывают 1 н. раствором соляной кислоты (2 раза по 10 мл), 1 н. раствором карбоната натрия (2 раза по 10 мл), 10 мл воды, высушивают над безводным сульфатом натрия и упаривают. Получен--ное в остатке масло вносят в эфир для кристаллизации и отфильтровывают. Полученный сырой продукт (3,31 кипятят в 30 мл этилацетата. После охлаждения суспензию оставляют стоять в течение нескольких часов в холодильнике и отфильтровывают, Получают 3,0 г (70%) -K-jc-Leu-ProНН, .Т.пл. 172-174 с; ,18 (4), -102,6° (, АсОН ).

Элементный анализ.

Рассчитано, %: С 58,34, Н 6,60, N 14,79.

Cg (мол .вес 473,50)

Найдено,%: С 57,52, Н 6,62, W 14,62.

Стадия 3. Амид U -2-кeтoимидaзo, лидин-4-карбонил-Ь-лейцил-Ь -пролина 1,2 г (2,4 ммояь Z -К c-Leu-ProKHg растворяют в 30 мл воды, раство смешивают с 0,25 г 10%-ного палладия на активированном угле в качестве катализатора и пропускают через смесь в течение 4 ч газообразный водород. Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат и аморфный остаток высушивают в вакууме над . Полученный продукт (0,75 г) растворяют в воде, раствор осветляют активированным углем и лиофилизуют. В итоге получают 0,61 г (71%) Ki c-Lem-Pro-NH , , Rj 0,35 (,5); с,32, -98,4 (С 1,АсОН).

Лминокислотньвй анализ. Leu 1,0 (1,0)-, Pro 0,96 (1 ,0).

Пример 7. АмидL-6-кетопипекалил-Ь-лейцйл-1,-пролина.

Ст;адия 1. Пентафторфениловый эфир L, -6-кетопипеколил карбоновой кислоты.

4,3 г (30 ммоль) 1н-6-кетопипеколиновой кислоты и 6,07 г (33 ммоль Р| р-ОН растворяют в 100 мл хлороформа и раствор при охлаждении льдом и перемешивании смешивают с 6,8 г(33 ммоль) ДЦГК. Смесь перемешивают в течение 1 ч при Ос, затем оставляют стоять на ночь в холодильнике. На следующий день выпавшую ДЦМ отфильтровывают, фильтра упаривают и кристаллический остаток растирают с Н-гексаном. Полученный сырой продукт (9,87 г) растворяют в 20 мл этилацетата, раствор оставляют стоять в течение 1 ч в холодилнике, затем осветляют активированным углем. Отфильтровывают и упаривают. Полученное в остатке масло растворяют в смеси 5 мл этилацетата и 20 мл И -гексана, раствор оставляют на ночь в холодильнике и на слдующий день выпавшие кристаллы отделяют фильтрованием. Получают 6,34

(68,5%) Крс-ОР{р. Т.пл. 96-98с, t(,0 ( этилацетат).

- Элементный анализ. Рассчитано,%: С 46,62, Н 2,61,

N 4,53, F 30,72.

(мол.вес 309,20) Найдено,%: С 46,37, Н 2,88,

N 4,26, 30,51.

Стадия 2. Амиг L -б-кетопипеколилL-лейцил-Ц-пролина. 1,32 г (5 ммоль) H-Leu-Pco-NH. нее суспендируют в 20 мл и при охлаждении льдом и перемешивании смешивают с 1,61 г (5,2 ммольУ Крс-ОРГР и 0,7 (5 ммоль) тризтиламина. Реакционную смесь перемешивают 5 мин, добавляют 0,7 мл (5 ммоль) триэтиламина, перемешивают еще 20 мин и Упаривают в вакууме. Кристаллический остаток растирают с эфиром, кристаллы отфильтровывают, промываю на фильтре эфиром и хлороформом и высугиивают. В итоге получают 1,27 г t72%) Kpc-Leu-Pbo-NH2. Т.пл. 214216°С, ,41 (5)-,ui -83°4c-l,AcO

Аминокислотный анализ. ,L -Амино-адипиновая кислота 0,99(1,0), ieu 1,00 (1,0); Pro 0,98 (1,0).

Пример 8. Амид L.-6-кетопипексшил-1,-норвалил-1-пролина,

Стадия 1. Хлоргидрат амидаL-норвалил-Ь-пролина.

2,2 г (20 ммоль) H-Pt o-NH2 и 3,83 г (10 ммоль) Вос-Р | a-OPf р растворяют в 40 мл ДМФА, выдерживают 5 мин и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 50 мл хлороформа, раствор промывают 1 н. соляной кисло.той (3 раза по 10 мл) , 1 н. раствором бикарбоната натрия (З раза по 10 мл 10 мл воды, сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают. Остаток растворяют в 10 мл этилацетата, смешивают с 10 мп 5 н, раствора хлористого водорода в этилацетате. Через 30 мин реакционную смесь разбавляют эфиром, выпавший осадок отфильтровывают и сушат в вакууме над едким натром. В итоге получают 1,83 г (73%) H-Hva-Pro-NHvHCe . ,10 (4),

Стадия 2. Амид L-б-кетопипеколил Ц-норвалил-Ь-пролина. 2,38 г (9,5 ммоль H-Nva-Pno-NH -HCp суспендируют в 30 мЛ и при охлаждении льдом и перемешивании смешивают с 30,09 г (Ю ммоль) и 1,33 мл (9,5 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивают 5 мин, добавляют 1,33 (9,5 ммоль) триэтиламина,перемешивают еще 20 ми и упаривают в вакууме. Кристаллический остаток растирают с эфиром, отфильтровывают, промывают на фильтре этанолом и высушивают. Полученный сырой продукт 3,66 г растворяют в воде, раствор осветляют активированным углем и упаривают, кристаллический остаток растирают с 10 мл этанола. Смесь оставляют в холодильнике и затем отфильтровывают. Получают 2,10 г (б5%) Kpc-Leu-Pfo-NH/г ., Т.пл.. 192-193°С, ,31 (5),i;oi.l -83,2° (.С 1, АсОН)..

Аминокислотный анализ,L -Аминоадипиновая кислота 1,02 (1,фНуа 1,0 (1,01, РКО 0,97 (1,0) .

Элементный анализ,

Рассчитано,%: С 56,78, Н 7,74, N 16,56.

С|(, МцО (мал,Вес 338,40)

Найдено,%: С 56 ,55 , Н 8,00, М16,37,

Пример 9, ДмидЬ -пироглутамил-Ь-лейцил-1 -пролина,

Стадия 1. Пентафторфениловый эфир бензилоксикарбонил-В-пироглутаминовой кислоты,

4,55г (18 ммоль )Z -D-CCp-OH и 3,68 (20 ммоль) PipOH растворяют в 50 мл этилацетата и раствор при перемешивании и охлаждении льдом смешивают с 4,12 г (20 ммоль) ДЦГК. реакционную смесь перемешивают. 1 ч при 0®С, затем отфильтровывают ДЦМ,

фильтрат у11а1:1ивают, остаток вяоскт в Н -гексан для крнста.члич тции. Полученный сырой продукт (7,3 г) растворяют в 20 MJ этилацетата, раствор оставляют в тсачеине 1 ч в 5 холодильнике, затем осветляют активированным углем и упаривают. Полученное в остатке масло растворяют в 5 мл этилацетата и добавлением 20 МП Н-гексана осанодагат продукт. 0 Получают 6,60 г (85%|Z-D-CGp-OPip. Т.пл. 81-82 с, ,84 .(1) -40,1 (, этилацетат. Элементный анализ. Рассчитано,%: С 53,16, н 2,82, 5 Ц 3,26, F 22,13.

5 (мол.вес 429,30) Найдено,%: С 53,28, Н 3,04, М 3,02, F 21,86.

Стадия 2. Амид бензилоксикарбо0 нил-D-пиpoглyтaмил-L-лeйцил-L-пролина.

3,24 г (12,3 ммоль) H-Leu-Pt-o-NH HC суспендируют в 50 мл ДМФА и при охлаждении льдом и перемешивании 5 смешивают с 5,6. г (13 ммоль) Z -DCCp-OPfp и 1,72 мл (12,3 ммоль) триэтиламина. Реакцлонную смесь церемешивают 5 мин, добавляют 1,72 мл .(12,3 ммоль) триэтиламина, переме0 шивают 20 мин и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 120 мл хлоро форма, раствор промывают 1 н. раствором соляной кислоты (2 раза по 30 мл5 , 1 н. раствором карбоната на, трия (З раза по 30 мл) и 30 мл воды, высушивают -над безводным сульфатом натрия и упаривают. Остаток вносят в эфир для кристаллизации. Полученный таким образом сырой продукт (5,31 г)кипятят с 50 мл этилацета0 га, полученную суспензию оставляют стоять 3 ч в холодильнике и выпавший в осадок продукт отделяют фильтрованием. Получают 4,61.г (80%) Z -О-C8p-Leu-Pro-VH2 Т,пл. 189-194 С. 5 ,44 (.4) -31/2° ( ,АсОН) .

Стадгя 3. Амид L-пироглутамиллейцил-Ь-пролина.

4,48 г (9,5 ммоль) -р-C€p-L,eu-ProNHj растворяют в 200 метанола и рАст0 вор смешивают с катализатором - 0,9 г 10%-ного палладия на активированном угле и через смесь пропускают в течение 1 ч газообразный водород. Затем катализатор отфильтро5 вывают, фильтрат упаривают, остаток растирают с эфиром. Полученный .продукт (3,07 г) растворяют в воде, раствор осветляют активированным углем и лиофилизуюг, В итоге получают 2,90 г (90,5%) D -CEp-Leu-pboНН ; ,40 С5),,, АсОН У,

Аминокислотный анализ. Glu 0,93 45 (1,0); Leu 1,0 (1,0); Pro 0,98(1,0),

Пример 10. I, -6-к(топиперидин-2-карбоиил-Ь -норвалил-1, гомопролина.

Стадия 1. Амид трёт-бутилоксикарбонил-Ь-гомопролина.

2,29 г (10 ммоль) Boc-HPfO-OH растворяют в 30 мл этилацетата, раствор смешивают с 1,4 мл (10 ммоль триэтиламина, охлаждают до -10°С и по каплям добавляют 1,3 мл (10 ммоль) иэобутилового эфира хлоругольной кислоты. После перемешивания в течение 15 мин при-Ю С в течение 0,5 ч пропускают через реакционную смесь газообразный аммиак, оставляют на 2 ч при 0-5с. Осадок затем отфильтровывают, фильтрат упаривают и полученное в остатке масло растворяют в 30 мл хлороформа. Раствор промывают 1 н. соляной кислотой (2 раза по 10 млj, 1 н раствором гидрокарбоната натрия (2 раза по 10 мл) и 10 мл воды,, высушивают над безводным сульфатом натрия, упаривают и полученное в остатке масло вносят в н-гексан для кристаллизации. Полученный таким образом сырой продукт (l,95 г)перекриталлизовывают из смеси этилацетата и эфира. Получают 1,78 г (78%) ВосHPt-o-NH. Т. пл. 138-140°С, R. 0,43 (2),85° (с 1 , АсОН ).

Стадия 2. Хлоргидрат амидаL гомопролина.

1,6 г (7 ммоль) Boc-HPi-o-NHg растворяют в 10 мл этилацетата и смешивают с 10 мл б н. раствора хлористого водорода в этилацетате. Через 1 ч реакционную смесь разбавляют эфиром, осадок растирают с эфиром и отфильтровывают.

В итоге получают 1,05 г (91%)НHPf-o- IH нее. Т.пл. 178-180°С Ц{ 0,32 (6) , ,2(C l, метанол) .

Стадия 3. Хлоргидрат амидаL норвалил-L-гомопролина. 0,99 г (б лмoль) H-HPho-NH HCE суспендируют в 20 мл ДМФА и при перем аниваниидобавляют 0,84 мл (б ммол триэтиламина и 2,3 г (б ммол.ь) ВоеNva-OPfp. Через 15 мин добавляют 0,84 МП (б ммоль) триэтиламина, перемешивают 1 ч и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 50 мл хлороформа, раствор промывают 1 н . pcicTBOpOM соляной кислоты, 1 н. раствором гидрок рбоната натрия (. раза по 10 мл , высушивают над безводным сульфатом натрия и упаривают. Полученное в остатке масло растворяют в 6 мл этилацетата и сманивают с 10 мл б н. раствора соляной кислоты в эткпацетате, через 1 ч реакционную смесь разбавляют эфиром, аморфный осадок растирают и высушивают в вакууме над безводнсйм едким нтром. 1( итог-е полу чают 1, 22 г (89,5%) 11-Nva-HProNll, HC . Н 0,12 (5 .

- Стадия 4. Амид L-б-кетопиперидин-2-карбонил-м-иорвалнл-L-гомоприл и н- .

1,22 г (5,37 ммоль) H-Nva-HProКИ2НСР растворяют в 20 глл ДМФА, cмeiIJИDaют с 0,75 мл (5,37 ммоль) триэтиламина и 1,7 г (5,5 млюль Крс-ОРГР. Реакционную смесь перемеишвают 5 мин, добавляют О,75 мл (5,37 ммоль) триэтиламина, перемешивают 20 мин и упаривают в вакууме Остаток растирают с эфиром и полученный аморфный сырой продукт 1,8 г наносят на колонку, приготовленную из 40 г с шикагеля, и элюиругот смесью растворителей (4). Фракции, содержащие чистый продукт, объединяют и упаривают. Получают 1,11 г чистого продукта, который растворяют в воде, осветляют активированным углем и лиофилизуют.В итоге получают Крс-Hva-HPro-N fi7 (53% от теории). Д{ 35 (5) , -44,б (, АсОН).

Фармакологическая активность трипептидов, полученных предлагаемым способом, изучена с помощью приведенных биологических тестов 1 - б.

1.Торможение галоперидоловой каталепсии у крыс. . ЖИВОТНЕЛМ подкожно вводят 40 мг/кг галоперидола 4И -хлорфенил)-1-3-(п-фторбензоил)пропил-пиперидин-4-ола и через 120 мин контролируют наступление каталепсии. Затем крыс разбивают на группы по 10 животных и внутривенно вводят дозами ТРГ-СЕр-Н 5PfO-NH2 и описываемые трипептиды. Животным контрольной группы вводят физиологический раствор поваренной соли. Через 15, 10, 90, 120 мин после обработки испытывали действие по увеличению каталепсии отдельных соединений, животные считались каталептическими, если их передние лапы, установленные на столбике высотой 7 см, не могли координировать свою позицию в течение 30 с.

Из числа животных, не показавших каталепсии, путем проббитанализа определяли соответствующее знчение для отдельных эффективных веществ.

Опыты проводили с мужскими особями крыс, имеющими вес 160 - 180 г.

2.Потенциирование локомоторной активности мьлшей, вызванной с помощ L-ДОпа,

Животным внутрибрюшинно вводят в дозе 40 мг/кг Н-метил-М-пропаргнлбензиламина (паргилин) , а затем 20 мг/кг ТРГ или описываемого трипептида, подлежащего исследованию, и, наконец, 100 мг/кгL -допа. Через 30, 60 и 90 мин после указанной об работки была измерена локомоторная активность животных. Установленные значения приведены в таблице в про центах, считая на значения, получе ные с животными, обработанными ТРГ Для этих опытов используют по 15 м шей-самцов весом 18-22 г. 3.Резерпино-гипотермическое возвратное действие на мышей. Мышей-самцов весом 18-22 г, разделя ют на группы по 10 животных, внутри брншинно вводят резерпином дозами 5 мг/кг. Через 16 ч животным вводят дозами по 20 мг/кг ТРГ или трипептида, подлежащего исследованию. Измеряют ректальную температуру животных перед обработкой резерпином (в таблице: норм.), через 16 ч после обработки резерпином в таблице: рез,) и через 1 или 2 ч после введения исследуемого трипептида (в таблице после обработки . В таблице указаны средние значения ректальной температуры, измеренной у групп по 10 мышей. 4. Влияние на продолжительность сна, вызванного гексобарбиталом. Мышам-самцам , разделенным на группы по 10 животных, йнутривенно вводят по 60 мг/кг гексобарбитала натрия, через 10 мин после этого животным внутрибрюшинно вводят доза ми по 20 мг/кг веса ТРГ или исследуемый трипептид, подлежащий исследованию. Время сна указано в табли це в процентах, считая на значения, измеренныо у животных контрольной группы (средние значения для групп по 10 животных). 5.Этанольный наркоз. Мышам сметанного пола весом по 1822 г, разделеннь.1 на группы по 20 животных, вводят внутрибрюиинно по 4,5 этанола. Через 10 мин после этого животным вводят внутрибрюшинно в дозе 20 Мг/кг исследуемый трипептид. Время сна в таблице указано в процентах (среднее значение рпя группы по 20 животных), считая на значения, измеренные у животных контрольной группы. 6.Гормональная активность (ТРГдействие) у крыс. Крысам-самцам (Wistar) с весом около 200 г, разделенным на группы по 7-8 животных, вводят внутривенно дозами по 20 мг/кг ТРГ или исследуемый трипептид. ТРГ -реакцию животных определяют через 15 мин после введения ТРГ или исследуемого трипептида из плазмы животного,в результате радиоиммунного исследования. Относительная эффективность рассчитана по методу четырех пунктов, при этом эффективность ТРГ принимали за 100. Средние значения биологической эффективности соединений общей формулы (1) f определенные в результате описанных фармакологических методов, представлены в таблице.

При меча ние. Время время гвксобарбитального сна: ;(Х±Е) 38,411,36 мин; этанольного сна: (XtE). 46,9±2,17 мин. Из данных таблицы видно, что опи сываемые аналоги ТРГ обладают эна« читальным действием на центральную нервную систему. С этгой точки зрения особенно преимущественными являются такие производные, у KOTOIXJX в положении 2 ТРГ-молекулы стоит алифатическая аминокислота с прямолинейной или разветвленной углеродной цепью. Предпочтительными являются с точки зрения этого действия также такие аналоги ТРГ, у которых в положении 1 находится 6-кетопипе колиновая кислота. У этих производиых гормональное действие ТРГ либо полностью отсутствует, либо воспроизводится до минимума, причем одновременно оказываемое на центральную нервную систему действие увеличивается существенно, в некоторых случаях даже в 8 раз.