Аналог Энкефалина,обладающий пролонгированной анальгетической активностью Советский патент 1985 года по МПК C07K5/107 A61K38/07 

Изобретение относится к. новому биологически активному соедииению аналогу энкефа шна, обладающему про лонгирован«ой анальгс тической актив ностью, которое может иай1« примене ние в медшщяе Известны природные метионин- и лейцин - знкефадияы Н Туг GlyGly-Phe-Het Ш и Н llyr - Gly-GlyPhe-Leu ОН, соответственно 1} I , проявляющие мор гноподобную активность в отштах на спехщфических моделях опиатного рецептора и подавляшф{е стереоспе1ц 4 1ческ6е связыва.вне с рецепторе опиатного антагониста налоксона в гомогенатах мозга Однако известные метионин- и лей Щ1Н - энкефалины проявляют слабую и кратковременную (5-15 мин) анальгезио при внутрижелудочковом ёведении в мозг мыши 2J и не активны при внутривенном, пероральном и других способах введения. Наиболее близким но химической структуре к описываемому соединению является аналог знкёфалина - (D Arg) лейцинэнкефалин, проявляняций анальгетическую активность при внутримозговом введении. При внутри венном введен1Ш зтоТ аналог анальгезией не обладае 3J . изобретения - расширение ар сенала средств воздействия на живой организм. Поставленная цель достигается описываемым аналогом знкёфалина формулы H-Tyr-D Arg - Gly - Phe ОН, обладающим пролонгированной анальге тической активностью. (D-Arg2, дез-L eu) - энкефалин синтезирован известными методами пептидной химии в растворе согласно приведенной схеме с использованием качестве конденсирующего агента дициклогексилкарбодиимида (ДСС), а та же пентафтррфениловых эфиров третбутипоксикарбонипаминоКИслот. Гуани диновая функция D-аргинина была защшцена нитрогрунпой, гидроксил тиро зина-бензильшда ра дикалом. Карбоксильную группу глицина защищали этерификацией. Вос-группы в синтезе пептида удаляли 50%-ным раствором трифторуксусной кислоты (TFA) в хлористом метилене. Нитро- и.бензильную защиты снимали каталитическ гидро г е ноЛИЗ ом. схема синтеза, приведена на чертеже. П р им ё р. Для синтеза (D-Arg, дез-L ей )-энкефалина используют аминокислоты и их производные фирмы Reanal (Венгрия). .Все аминокислоты кроме D-аргинина имеют 1-конфигурацию. Температуру плавления веществ определяют в капилляре (без коррекции) . Индивидуальность промежуточных соединений контро,лируют с помощью тех на пластинках Silufо1 (ЧССР) в следуют их системах растворителей: хлороформ-зтанол-уксусная кислота, (АсОй), 85:10:3 (А), н-бутанол-пйридин-AcOH-HjO, 15:10:3:6 (В), н-бутанол-AcOH-HjO, 4:1:1 (С). Аналог энкефалина хроматографируют на пластинках фирмы Meek в системах: хлороформ-метанол- АсОН-Н О, 30:20:4:6 (Д). Удельное оптическое вращение пептидов измеряют на поляриметре Регkin-Eiffler 141 С (ФРГ). Кислотный гидролиз Проводят в запаянных ампулах в 6 Н. соляной кислоте при 120 С в те сение 24 ч. Аминокислотш 1Й состав определяют на анализаторе Ieol-3. Для всех соединений данные элементного анализа удовлетворительно совпадают с вычисленным содержанием С, Н, N, Этиловый зфир N-трет-бутилоксикарбонил-N -нитро-В-аргинилглицина (1). К раствору 6,38 г (20 ммоль) N -трет-бутилоксикарбойнл-М -нитроD-аргинина и. 3,24 г (24 миоль). 1оксибензотриазола в 20 мл диМетилфосмамида () при охлаждении до прибавляют 4,12 г (20 ммоль) дициклогексилкарбодш1мида (ДОС) в 8 мл ДМФА, перемешивают 3 ч при , затем добавляют 3,07 г (22 у моль) зьтилового зфира глицина гидрохлорида, 3,08 мл (22 ммоль) трИзтиламина и перемешивают 24 ч пщ . Реакционную массу разбавляют зтипацетатом и водой (до разделения слоев). Этилацетатный;слой отделяют и пршьшают. последовательно 5%-ным растворе KHSO, 5%-ным раствором NaHCOj, водой, насыщенным раствором NaCl, сушат над безводным Na SO. Растворитель отгоняют, остаток пеJ}eкpиcтaллизoвывaют из зтилацетата. Выход: 6,24 г(77%), т.пл. 119°С (размягчается при ) , -13,5° (с 1, ДМФА); ,68 (В). Этиловый эфир N-трет-бутило.ксикарбонил-О-бензил-Ь-тирозил-Н -нитpo-D-аргинилглицина. 4,04 г (10 ммоль) дипептида (1) растворяют в 15 мл 50%-ного раствора TFA в дихлорметане и выдерживают 30 мин. Растворитель отгоняют, оста ток растирают с эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над КОН. Получают 4,01 г (96%) трифторацетата (II), ,48 (В). 2 г (5 ммоль) трифторацетата (II растворяют в 10 мл ДМФА, охлаждают до -5°С и при перемешивании добавляют 0,7 мл (5 ммоль) триэтиЛамина в 2 мл ДМФА и 2,46 г (5 ммоль) п-нитро фенилового эфира Ы-трет-бутилоксикар бонш1-0-бензил-Ь-тирозина, растворен ного в 10 мл ДМФА. Смесь выдерживают 1 ч при , 24 ч при о С и еще 24 ч при комнатной температуре. Зате реакционную массу выливают в 500 мл воды со льдом, вьщелившееся в осадок вещество отфильтровывают. Осадок растворяют в этилацетате и промывают 5%-ным раствором KHSO, водой, 5%-ны раствором KHCOj, водой, насьщенным раствором NaCl и высушивают над безводным NajSO. Растворитель отгоняиз этилацетата. Получают этиловый эфир Ы-трет-бутилоксикарбоннл-О- бензил-Ь-тирозил-С-нитро-Ц-аргинилглицинаВьвсод: 1,77 (54%) трипептида (III Т.Ш1. 162-164°С, , (с 1, ДМФА); R 0,65(А).. N-трет-бутилоксикарбонил-О-бензил Ь-тирозил-Н -нитро-В-аргинилглицин (IV). 0,66 г (1 ммоль) трипептида (III) растворяют в 15 мл метанола, прибавляют 1 н. раствор NaOH до рН 10-11 и вьщерживают несколько минут до окончания гидролиза (хроматографический контроль). Отгоняют растворитель, добавляют воду и под- кисляют 1 н НС1 до рН 3. Выпавший осадок отфильтровывают и хроматографируют на колонке с силика гелем в системе хлороформ-этанол-этилацетатAcOH-HjO, 85:5:8:2:0,25. Получают 0,34 г (54%) трипептида (IV), т.пл. , ,5 (с 1, ДМФА); ,60 (С). N-трет-бутилоксикарбоншт-О-бензил-l-тиpoзил-N -нитpo-D-аргинил-глицил-Ь-фенилаланин. 3,15 г (5 ммоль) трипептида (IV) растворяют в 10 мл этилаЦетата, охлаждают до и при перемешивании добавляют 1,01 г (5,5 ммоль) пентафторфенола и 1,13 г (5,5 ммоль) ДСС, растворенных в этилацетате. Через 2 ч смесь охлаждают до -10 С, выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывают, растворитель отгоняют, маслообразный остаток растирают с гексаном до затвердения. Получают 3,54 г пентафторфенилового эфира (V), ,90 (С). . 0,73 г (4,45 ммоль) L-фенилаланина (VI) растворяют в 6 мл ДМФА и при перемешивании добавляют 0,62 мл (4,45 ммоль) триэтиламина в 2 мл ДМФА и 3,54 г (4,45 ммоль) пентафторфенилового эфира (у), растворенного в 4 мл ДМФА. Реакционную массу перемешивают несколько часов, ДМФА отгоняют при 40 С, остаток растворяют в этилацетате и обрабатывают аналогично соединен1ло (III). Продукт, полученный после отгонки раствори- теля, хранят в эксикаторе. Получают К-трет-бутилоксикарбонил-О-бензил-Ьтиррзил-С-нитро-D-аргинил-глицил-Lфениланин (VJ.I). Выход: 1,43 г (41,5%) защищенного тетрапептида (VII), ,27 (А, Merk). Ь-тирозил-1)-аргинил-глицил-Ьфенилаланин. 0,320 г (0,412 ммоль) тетрапептида (VII) растворяют в 6 мл 50%-ного раствора TFA в дихлорметане и вьщёр- живают в течение 30 мин. Раствор упаривают, остаток растирают с эфиром, сушат в вакуум-эксикаторе над КОН. Получают 0,300 г трифторацетата тетрапептида (VIII) ,61 (Д). К раствору 0,300 г (0,380 ммоль) соединения (VIII) в 5 мл метанола добавляют палладиевую чернь, 0,2 мл уксусной кислоты и гидрируют 6 ч при 20 С. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха, остаток растирают с эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром на фильтре, сушат над КОН в вакууме. Полученный продукт (0,250 г) очищают на КМ-целлюлозе (СМ-32, фирма Whatman) в аммоний-ацетатном буфере (г адиентное элюирование). Поглощение раствора измерялось при 206 и 254 нм (Uvicord-III, I КБ, Швеция). Соответствуювще фракции собирают и лиофилиз ют. Получают L-тирозил-Р-аргинил-гли цил-Ь-фенилаланин ,(1Х). -Выход: 0,135 г (52%) тетрапептида энкефаляна (IX), .+46,6° (с 1, н АсОЙ); ,4 (Д); ,5 (В) аминокислотного анализа удовлетворительны. Биологическая активность (D-Arg дез-L eu)-энкефалина была исследована в cMtoTax in vivo по методу Ueda Н. at al. В работе использованы беспород. ные мьпви-самцы массой 20 г. Исследуемое вещество, растворенное в стерильном физиологическом растворе, вводят при помощи 1-образной иглы в cisterna Hiagna мозга неанестезирован ным мышам в количестве 10 мкл. Был исследован диапазон доз: 0,05 100,0 мкг/жив. Контрольным животным вводят to мкл стерильного физиологического раствора. Каждая экспериментальная группа состоит из 10 мьшей. Анальгетический эффект описываемого соединения оценивайт по тесту tail pinch при помощи артериального зажи ма, накладьшаемого на основание хвоета. Определениеболевой реакции проводят через 5, 15, 30, 60, 90 мин после введения и затем каждые 30 мин до исчезновения анальгетической реакции. Результаты выражают альтернативным методом в проценте мышей, показавших анальгетическую реакцию. При вычислении ЕД (эффективная доза исследуемого Вещества, которая вызывает нальгетический эффект у 50% подопытных яйивотных) использзпот метод Литчфилда и Уилкоксона. Анальгетическая активность исследованных соединений приведены в табл. 1, 2 и 3. Как видно . 1, 2 и 3 (D-Arg , дез-L )-энкефалин обладает выраженной анальгетической активностью. Максимальный эффект наблю дается на 5-30 мин после введения. Днальгетическая активность описываемого аналога энкефалина значительно превышает активность природных энкефалинов. (1,2) и в 12 раз превышает анальгетическую активность прототипа - (1)-Аг§)-лейцинэккефалина (3), а также в 4 раза превышает анальгезию морфина на молярной основе (см. табл. 1). Более того, описывае мый аналог энкефалина в отличи своего структурного аналога акпшен при знутривенном введении (ЕД5.. 19,0 мг/кг). . Характерной особенностью синтезированного аналога является значительная пролонгация анальгетического эффекта. Продолжительность анальгетической реакции при ,g Jсоставляет 1,5 ч против 15 мин у энкефалинов или, например, 30 мин у известного аналога энкефалина с длительным действием - (D-Ala)-метионинэнкефалинамвда. Описьшаемое соединение в дозе 25 мгк/животное вызывало анальгезию 88% в течение 5 ч при интрацистернальном введении, при внутривенном введении дозы 130 мг/кг продолжительность анальгезии превышала 6,5 ч. Токсических явлений при этих дозах не наблюдалось. Поскольку анальгетическая активность описьшаемого аналога энкефалина была исследована в.диаг азоне доз от ,0,05 до 100 мкг/животное, то на основании этих данных (см. табл. 3) была вычислена эффективная доза (ЕД5.р) ,. составившая 0,44 нмоль/животное или 0,3 мкг/жи-. вотное. Из данных т&блицы видно, что токсические признаки соединения начинают проявляться в дозах, превышающих эффективна в 333 раза .100 мкг/животное ч ( ) следовательно, 0,3 мкг/животное терапевтический индекс ДЦ j. () составляет в.еличину большую чем 333, и является достаточно безопасным интервалом для лекарственного средства. Интервал между дозой, вызывающей минимальный анальгетический эффект, и дозой, вызывающей первые признаки токсичности (терапевтическая широта), также достаточно велик. Он составляет оппл / 100 мкг/животное -. 2000 (тгтТс7 ) что так0,05 мкг/животное же является бозопасньм для. лекарственного средства. Проведенные исследования показали что описьшаемый (D-Arp дез-Leu)энкефалин может найти применение в медицине в качестве анальгетика, f пролонгированным де ствием. Анальгетическая активность энкефалина при интрацистернальном введении мьшам Таблица 1 и его аналогов (метод tail pinch)

1) ЕД - эффективная доза, вызывающая реакцию у 50% подопытных животных.2 ЕДьо-вр

3)в работе использовался морфин-гидрохлорид производства Ташкентского ХФЗ,

Анальгетическая активность (D-itrg , дез-Ьеи-) энкефалинов при внутривенном введении мьшгам (метод tail pinch)

Таблида2

О

100% анальге зия 100% держалась более 6,5 ч Анальгетическая активность (D-Arg, интрацистернальном введении

Соединение

, г, 5D-Arg - дез Leu

энкефалин

60% - анальгезия (6 мьш1ей из 10 показали анальгезию)

20% -.летальный исход (2 мыши из 10 умерли на 5-ой мин после введения) ТаблицаЗ дез-Ьеи) энкефалина при мышам