Способ промышленного изготовления очищенного и концентрированного (адсорбированного) столбнячного анатоксина Советский патент 1959 года по МПК A61K39/00 

Известны способы промышленного изготовления очищенного и концентрированного столбнячного анатоксина.

Предлагаемый способ дает возмол ность получения высокоактивного столбнячного токсина. Это достигается тем, что используют гидролизатную (безмясную) питательную среду, приготовленную на основе смеси кислотных гидролизатов казеина, рыбокостной и кукурузной муки, и адаптированный к этой среде штамм столбнячной палочки «Колле № 8, полученный в результате выращивания при 35° на протяжении б-10 суток, токсин переводят в анатоксин обычным способом обработкой формалином, а затем очищают и концентрируют комбинированным осаждением растворами хлористого натрия и соляной кислоты с последующей адсорбцией на гидроокиси алюминия и дальнейшей обработкой и использованием готового анатоксина по известным схемам.

Способ осуществляется следующим образом.

Приготовление кислотного гидролизата казеина. 8 кг сухого казеина растворяют в 100 л водопроводной воды; к этому раствору добавляют 1 кг концентрированной чистой соляной кислоты, уд. в. 1,18. Смесь перемешивается и нагревается до 80°, вторично перемешивается и кипятится 20 мин., после чего производят гидролиз при 1 атм давления в течение 20 мин.

Приготовление кислотного гидролизата рыбной муки и кукурузы. 10 Кс рыбной муки и 3,3 кг размолотой кукурузы суспендируют в 100 л водопроводной воды, добавляют 1,3 кг концентрированной соляной кислоты, перемешивают и ведут гидролиз в течение 4 час. при давлении 1,5 илм.

Кроме гидролизата из рыбной муки и кукурузы готовят гидролизаты из одной рыбной муки по такой же прописи.

jYo 121909

Из указанных гидролизатов готовятся среды с 40Vo гидролизата казеина и рыбо-казеиновая среда по следующим прописям.

Приготовление казеиновых сред с кукурузным экстрактом. Берут гидролизата казеина, добавляют 56% воды, тщательно перемешивают и нагревают до 80°. Добавляют 3iVo кукурузного экстракта и 0,4% поваренной соли, смесь доводят 20%-ным раствором щелочи до рН 7,2 и кипятят 5 мин. После кипячения рН доводят до 7,2 и добавляют по O.rVo НРО4 и К2НРО4, перемещивают и кипятят 10 мин. Фильтруют в горячем виде. Стерилизуют среду при 0,5 атм. в течение 30 мин.

Среды К20 и КШ приготовляют аналогично тому, как готовят среду с 40% гидролизата казеина с той лищь разницей, что в одном случае берут 20Vo гидролизата (К20) и в другом 10% гидролизата по описанной ПрОПИСИ.

Приготовление рыбо-казеиновой среды.

Берут г дрол 1зата рыбной муки и 5% гидролизата казеина, добавляют воды, неремещивают и нагревают до 80°. Добавляют 3% кукурузного экстракта и 0,4Vo NaCl, смесь доводят 2QVo-nbiM раствором NaOH до рН 7,2 и кипятят 5 мин. После кипячения рН доводят до 7,2 и добавляют по 0, Na2HPO4 и К2НРО4 перемешивают и кипятят 10 мин. Фильтруют в горячем виде. Среда стерилизуется при 0,5 атм. в течение 30 мин.

Химический состав по азотистым компонентам в казеиновых средах отличается от рыбо-казеиновых сред по количеству нерасщепленного белка. В среде с 40% гидролизата казеина нерасщепленного белка почти к двое больще по сравнению с рыбо-казеиновой средой.

Приготовление нативных столбнячных анатоксинов на безмясных средах.

Путем адаптации щтамма столбняка «Колле № 8 к казеиновым средам получают штамм, дающий на казеиновых средах с 40/о гидролизата токсин, активностью 500 тыс. - 1 млн. в 1 мл, а на рыбо-казеиновой среде от 1 до 4 млн. в 1 мл. Максимальная сила столбнячного токсина на этих средах наблюдается на 6-10 день культивирования. Возраст посевного материала от одних суток до 2 лет. Выращивание производится при 35° С.

Полученные токсины переводят в анатоксины путем добавления 4% формалина и выдерживания в термостате при 38°. Полное обезвреживание анатоксинов на 40Vo гидролизата казеина и рыбо-казеиповой среде происходит за 10-13 дней.

Столбнячные анатоксины, приготовленные на безмясных средах, подвергались концентрации и адсорбции. Для концентрации столбнячното анатоксина применен метод осаждения анатоксина однонормальным раствором в изоэлектрической точке. Непосредственно перед осаждением нативный анатоксин сепарируют для удаления из него микробных тел. К прозрачному раствору анатоксина добавляют 15% сухой поваренной соли при непрерывном помещивании раствора. После полного растворения соли осторожным добавлением соляной кислоты рН понижают до 3,5. Осажденный анатоксин оставляли в комнате (температура 20-22°) на 16-18 час. Образовавщийся осадок отделяют на центрифуге или Сепараторе от маточного раствора и растворяют в фосфатном буфере (рН 7,40) из расчета 25-30-кратной концентрации по объему. РП полученного концентрата в зависимости от серии и среды колеблется в пределах 6,50-4,20.

В тех случаях, когда при растворении осадков в фосфатном буфере рН сдвигается ниже 5,20, растворение осадков бывает неполным, что