СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ Советский патент 1967 года по МПК C12N9/14 

Известны способы получения ферментных препаратов путел культивирования продуцирующих их микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники азота, с добавлением других питательных веществ, нацример углеводов и минеральных солей, необходимых для роста, при температуре 20-35°С в аэробных условиях с последующим выделением ферментных препаратов из биомассы одним из известных способов, например высаливанием сульфатом аммония, адсорбцией, высущиванием культуральной жидкости.

Согласно предлагаемому способу получают препараты с высокой активностью, содержащие протеолитические ферменты, способные к расщеПоТепию кератина, в сочетании с ламинариназой, хитиназой, эластазой и липазой. Для этого в качестве продуцирующих микроорганизмов используют бактерии рода Цитофага (Cytofaga) «NCIB 9497.

Предлагаемый способ заключается в следующем.

Культуру бактерии рода Цитофага (Cytofaga) «NCIB 9497 выращивают на питательной среде поверхностным способол или глубинным в аэробных условиях.

раллельны, концы закруглены, разделены, а иногда спарены между собой. Окрашивают по Граму после выдерживания на питательном агаре в течение трех дней при 20°С. Грам - отрицательные, короткие, прямые палочки с параллельными сторонами, концы закруглены, внещний вид окраски - неровные полоски.

Аналогичный внещпий вид имеют при выращивании на агаре, содержащем пептон и глюкозу. Окращивапие однородно после культивирования на кровяном агаре.

Рост на различных средах. На агаре (четырехдневное культивирование при 20°С) -светло-желтые, просвечивают, округлой формы, выпуклые, полностью гладкие, лоснящиеся, 1 -1,5 мм в диаметре, с острым запахом.

На агаре, пептоне и глюкозе (четырехдневное культивирование при 20°С) - светло-желтые, просвечивают, округлой формы, выпуклые, полностью гладкие, лоснящиеся, слизеподобны, 1-2,5 мм Е диаметре, с острым запахом.

На кровяном агаре (четырехдневное культивирование при 20°С) - серовато-желтые, просвечивают, округлой формы, выпуклые, полностью гладкие, лоснящиеся, 1 -1,5 мм в диаметре, с острым запахом.

назначительное липкое, тягучее и вязкое отложение. Слабый рост . отмечался также при

опор

.V- j «%-- „,

На воде, содержащей пептон (двухдневное культивирование при 20 и 30°С) - рост незначительный, очень слабая неоднородная замутненность.

На воде, содерл ащей пептон и глюкозу {двухдневное культивирование при 20 и 30°С)-умеренный рост, слабая, неоднородная замутненность.

Зависимость между ростом и температурой. При температуре 5 или 10°С роста не наблюдается. Недостаточный рост при 37°С. Отсутствует чувствительность к пенициллину и стрептомицину. Чувствительность к хлорамфениколу и гидротетрациклину. Не вызывает образования кислоты или газообразных продуктов в результате воздействия па глюкозу, мальтозу, маннитол или крахмал при 20 или 30°С. Отсутствует реакция в среде по Хьюгу и Лейфсону, содержащей глюкозу.

Лакмусовое молоко пептопизируется, а индикатор восстанавливается при 20°С и нептонизируется при 30°С. Желатину разжижает при 20°С. Оксидаза по Коваку положительна При 20 и 30°С. Образования индола не происходит, метил-красный отрицателен, ацетометилкарбинол не вырабатывается, аммиак выделяется из пептона при температурах 20 и 30°С. Цитрат утилизируется как источник углерода в виде золя при 20 и 30°С. Образования липазы или лецитиназы на агаре, содержащем желток куриного яйца, не наблюдается при 20 илп 30°С.

Питательные среды, используемые для культивирования, содержат главным образом источник азота с добавлением в случае необходимости углевода и (или) питательных солей. К числу источников азота относятся солодовый экстракт, мясной экстракт, пептон, замочная жидкость кукурузы или зерна, однако, наиболее пригодным источником азота является мицелий, подученный как отход в производстве антибиотиков. При этом необходимо отметить, что источник азота может полностью удовлетворить потребность выращиваемого организма Цитофага «NCIB 9497 в углероде или в других питательных солях без их добавления. Так, например, данный микроорганиз.м сможет развиваться на среде, состоящей только из мясного экстракта и пептона. В некоторых случаях добавление углеводов, например глюкозы, мальтозы, оказывается необходимым.

К числу элементов, которые также могут оказаться необходимыми, относятся магний, железо и цинк.

Культивируют Цитофагу «NCIB 9497 при температуре 20-35°С (оптимальной является температура 26°С), рН среды находится в пределах 5-8, предпочтительно 5,5-6.

Образующуюся культуральную жидкость можно или использовать непосредственно, или извлечь из нее ферментный комплекс одним из известных способов. Так, например, куль5 туральную жидкость высущивают или осветляют (цептрифугированием), после чего высушивают (можно методом вымораживания), получая при этом неочищенный препарат. Для получения очищенного препарата производят осаждение последнего ацетоном илп высаливанием сульфатом аммония, или адсорбцией на каолине.

Полученный нрепарат содержит комплекс следующих ферментов: протеазу, ламинарина5 зу, хитиназу, кератиназу, эластазу и липазу. Этот комплекс ферментов способен вызывать распад мицелия у различных грибковых организмов, например плесени рода Пенициллиум и Цефалоспориум.

0 Способность вызывать распад грибкового мицелия позволяет использовать вышеуказанный комплекс ферментов для уничтожения отходов мицелия после производства антибиотиков, особенно продуктов цефалоспорина.

5 Полученный при этом растворимый материал может быть использован как питательная среда для проведения последующих процессов ферментации. Степень, до которой ферментный комплекс воздействует па грибковый мицелий, зависит от видов мицелия в каждом конкретном случае.

Отмечалось кератиназное действие комплекса ферментов, который действует, по-видимому. Не. волосы.

5 Способен разлагать желатину, казеин, воздействовать на кератин, причем действие его протекает быстро.

Данный комплекс можно использовать: в производстве хлебобулочных изделий; 0 при изготовлении блюд из хлебных злаков (например, овсянка, кукурузные хлопья);

для ускоренного созревания мяса с целью его размягчения;

для защиты от охлаждения во время циво5 варения;

в производстве кормов для животных; в производстве протеиновых гидролизатов; для мягчения крупного кожевенного сырья и обезволашиванпя щкур;

для удаления пятен по методу сухой чистки; для удаления щлихты с текстильных изделий;

в медицине.

Пример 1. Конические колбы (250 мл), содержащие по 40 мл следующей среды, (%): мальтоза4

солодовый экстракт2,4

пептон1

дистиллированная вода - до 100.

Водородный показатель рН 7 установлен dOT на аппарате путем возвратно-поступательного движения с амплитудой 5 см, действующей при 200 об/мин при температуре окружаюш.ей среды 26°С. Через два дня после начала инкубации культура характеризуется сильным литическим действием по отношению к Цефалоснориум акремониум (Бротцу) «IMI -49137. При мер 2. Конические колбы (250 жл), содержащие 100 мл следующей среды, %: мясной экстракт1 пептон1 хлористый натрий0,5. Водородный показатель среды устанавливают до значения рН 8 добавлением гидрата окиси натрия, кипятят 1 час, фильтруют, доводят среду до рН 7,2 путем добавления соляной кислоты, инокулируют с помощью петли культурой микроорганизма Цитофага «NCIB 9497 и инкубируют при температуре 26°С. Содержимое колб перемешивают на аппарате с возвратно-поступательным движением, с амплитудой 5 см, при 200 об/мин. Спустя один день после начала инкубации культура характеризуется сильным литическим действием по отношению к «К. акремониум. Пример 3. З.Л среды следующего состава (стерилизована 30 мин при температуре 120°С), %: мицелий «К. акремониум, отжатый в сыром виде6 кислый фосфорно-кислый калий вторичный0,07 первичный0,03 сернокислый магний 7Н2О0,05 сернокислое железо 7Н2О0,001 сернокислый цинк 7Н200,001 глюкоза (стерилизована отдельно) 0,25. Инокулируют 60 мл хорошо разросшейся культуры микроорганизма Цитофага «NCIB 9497. Культуру выдерживают при температуре 26°С, перемешивают при 550 об/мин и аэрируют путем пропускания воздуха со скоростью 3л/мин в течение 20 час, затем следующие 4час - со скоростью 1 л/мин и в заключение 2 час - со -скоростью 0,5 л/мин. Культуру осветляют центрифугированием и всплывшую жидкость лиофизуют. Получают 6,6 г твердого вещества кремовой окраски, обладающего литической активностью по отношению к «К- акремониум и протеолитической активностью по отношению к казеину. Пример 4. 1,5 л жидкой культуры, выращенной, как указано в примере 3, центрифугируют, доводят среду до рН 6,1 добавлением уксусной кислоты и затем концентрируют в вакууме при температуре ниже 40°С до объема 250 Л1л. Концентрат медленно добавляют к 2 л ацетона, охлажденного до +5°С, при энергичном перемешивании. Продукт светлокоричневой окраски в количестве 7,4 г промывают ацетоном и высушивают над пятиокисью фосфора. Полученный продукт характеризуется высокой активностью. Пример 5. 2л жидкой культуры, выращенной, как указано в примере 3, освобождают от твердых примесей центрифугированием и затем медленно выливают при перемешивании в 20 .л ацетона, охлаждаемого льдом. Продукт отфильтровывают, промывают водой и высушивают над пятиокисью фосфора; вес продукта - 10 г. Продукт обладает полной активностью, присушей первоначальной жидкой среде. Пример 6. Кусочки свежей телячьей шкуры погружают в 1%-ный раствор ферментного препарата (полученного, как описано в примере 5) в буферной среде «Трис М/50 при рН 7. Выдерживают 18 час при температуре 37°С, после чего волосяной покров легко удаляют, осторожно соскребывая. Диалогичная обработка в буферной среде «Трис без добавления приготовленного препарата оставляет волосяной покров таким же, каким он был до обработки. Пример 7. Мицелий «Трихофитон рубрум (один из грибков, вызывающих грибковое заболевание ног) приготовляют путем культивирования в сосуде, приспособленном для встряхивания в течение 24 час при температуре 26°С в среде, содержащей пептон и солодовый экстракт. Полученный мицелий отфильтровывают и суспендируют на уровне 0,2% в 0,2%-ном растворе заранее приготовленного ферментного препарата (полученного, как указано в примере 5) в буферной среде «Трис М/50 при значении рН 7. Мицелий полностью растворяется после трехчасовой выдержки при температуре 27°С. Пример 8. Адсорбция ферментного препарата на каолине. К 600 мл ферментационной жидкой среды, полученной, как указано в примере 4, добавляют 1,65 г каолииа, затем отдельными порциями вносят 180 г сульфата аммония при механическом перемешивании до полного растворения. Смесь каолина с протеином отделяют фильтрованием, промывают водой и затем высушивают при комнатной температуре в вакуум-сушильном шкафу. Продукт весом 11,7 г обладает полной активностью, присущей первоначальной жидкой среде. Предмет изобретения Способ получения ферментных препаратов путем выращивания продуцирующих их микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники азота, с добавлением других питательных веществ, необходимых для роста, например углеводов и минеральных солей, в аэробных условиях, с последующим выделением ферментных препаратов из полученной биомассы одним из известных способов, отличающийся тем, что, с целью получения препаратов с высокой активностью, содержащих протеолитические ферменты, способные к расщеплению кератина, а также ла7мнкарииазу, хитиназу, эластазу и липазу, в качестве продуцирующих микроорганизмов ис8пользуют бактерии рода Цитофага (Cytofaga) К° «NCIB 9497.