Способ определения В-лимфоцитов Советский патент 1990 года по МПК G01N33/533 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, к изу- -чению иммунологического статуса.

Цель изобретения-сокращение времени анализа и упрощение способа.

Способ осуществляется следующим-образом.

Сухую люминесцирующую сыворотку против глобулинов человека, меченную од- ним из флюоресцирующих агентов (например ФИТЦ, рода.мин или другой), растворяют в .соответствии с инструкцией. Раствор освобождают от нерастворяющихся примесей центрифугированием при 3000 об/мин Б течение 30 мин,

Выделенные на градиенте верофикол- ла лимфоциты дважды отмывают средой 199 и готовят взвесь, содержащую 2-10 клеток в 1 мл взвеси. К 0,5 мл взвеси лимфоцитов добавляют равный обьем предварительно отцентрифугированной люминесцирующей антисыворотки, тщательно ресуспендируют и выдерживают при 37°С 20 мин при периодическом осторожном встряхивании.

Взвесь лимфоцитов, обработанных антисывороткой, дважды отмывают 8-10-кратным объемом изотонического раствора NaCI. Осадок тщательно ресуспендируют и каплю его переносят на предварительно обезжиренное предметное стекло.

К капле взвеси добавляют капиллярной пастеровской пипеткой небольшую каплю заранее приготовленного флюоресцирующего агента, способного прокрашивать лимфоциты и давать при просмотре в люминесцентном микроскопе иную по цветности флюоресценцию. Содержимое капли перемешивают, покрывают покровным стеклом и прогревают над пламенем горелки до .

В зависимости от особенностей использованного для прокрашивания лимфоцитов флюоресцентного агента препараты либо сразу микроскопируют, либо после дополнительной обработки, повышающей эффективность окращивания. Далее препараты подвергают люминесцентно-микроскопиче- скому исследованию. Подсчитывают число

(Л

о о

СА) СА

О

ON

специфически светящихся В-лимфоцитов (точечное и кольцевое свечения) на 200 клеток, отчетливо идентифицирующихся в том же режиме микроскопии. Содержание В- лим(Ьоцитов выражают в процентах.

П р и м е р 1. Используют сухую кроличью люминесцирующую сыворотку против глобулинов человека производства Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалея АМН СССР, меченную флюоресцеинизотиоцианатом(ФИТЦ).

Поскольку антитела, меченные ФИТЦ, дают зеленое свечение, то для мечения лимфоцитов используется зтидиум бромид, который окращивает лимфоциты в красный цвет. Для приготовления рабочего раствора этидиум бромида 1 мг его растворяется в 250 мл изотонического раствора NaCI {-10, -10 моль/л). Рабочий раствор хранится при+4°С.

Одну каплю рабочего раствора этидиум бромида добавляют непосредственно на предметное стекло во взвесь лимфоцитов, обработанных предварительно антиглобу- линовой сывороткой, меченной ФИТЦ. Предметное стекло покрывают покровным и прогревают, равномерно пронося над пламенем спиртовки, до «€0°С. При этом обеспечивается эффект окрашивания лимфоцитов. Далее препарат подвергают люминесцентной микроскопии с использованием иммерсионной системы (возбуждающий свет 480-700 нм, запирающие светофильтры ЖС18+ЖЗС19), Лимфоциты при этом дают равномерное красное свечение, а В-лимфоциты - дополнительно специфическое точечное или кольцевое зеленое свечение, обусловленное связанными

антиглобулиновыми антителами, меченными ФИТЦ.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет упростить определение общего количества лимфоцитов, дискриминировать

В-лимфоциты и уменьшить время анализа на 3 ч.

Формулаизобретения Способ определения В-лимфоцитов путем выявления поверхностных иммуноглобулинов с помощью добавления к лимфоцитам люминесцирующей антиглобу- линовой антисыаоротки и окрашивания на предметном стекло флюоресцирующим агентом, отличающийся тем, что, с

целью сокращения времени анализа и упрощения способа, в процессе окрашивания лимфоцитов флюоресцирующим агентом предметное стекло прогревают над пламенем горелки до 60°С.

Изобретение относится к области медицины, а именно клинической иммунологии. Целью изобретения является упрощение способа и сокращение времени определения. Для этого после добавления к лимфоцитам люминесцирующей антиглобулиновой антисыворотки при прокрашивании на предметном стекле, его прогревают над пламенем спиртовки, тем самым сокращая время анализа на 3 ч и достигая упрощения способа.