(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА
;з
зрачный, беловатый, виоследсттзии цвет его переходит в темно-желтый. Слегка вязкий. Диффундирующий пигмент не образуется.
Питательный бульон и бульон на дрожжевом экстракте. Обильный рост. Мутный. С течением времени может происходить образование осадка и иногда образование иленки.
с дрожжевым экстрактом. Рост только на поверхности. В анаэробных условиях роста нет.
Ограниченно растет при 4°С, умеренный до обильного наблюдается рост при температуре от 10 до 32С, плохо растет при 37°С и совсем не растет при 41°С. рН среды от 4,5 до 11,00, нрсдпочтительным является рН 5,5-9,5.
Добавление NaCl влияет на рост; при добавлении 12% NaCl нет роста, умеренный рост наблюдается при добавлении 5% NaCl или менее.
Штамм Pseudomonas sp. D 946-В 83 производит диффундируюгций флуоресцентный пигмент в некоторых средах.
Антибиотик получают выращиванием щтамма Pseudomonas sp. D 946-В 83 АТСС 31086 в аэробных условиях на питательной среде, содержащей: источники углерода, например, глюкозу, фруктозу, маннозу, глицерин; способный к ассимиляции источник азота, например, рыбную муку, соевую муку, пентоны; неорганические соли, например, соли натрия, калия, аммония, кальция, фосфата, сульфата, хлорида, бромида, нитрата, карбоната.
Температура выращивания 28-30°С. рН среды 5,5-9,5, предпочтительно 7,0. Выращивание осуществляют в течение 3-5 дней.
Если ферментацию проводят в чане, то получают вегетативный прививочный материал в питательпом бульоне инокулирования бульонной культуры косой или почвенной культурой или лиофилизированной культурой организма. После получения активного прививочного материала его асептически переносят в среду чана для ферментации.
Хорощо развивщийся на косом агаре щтамм Pseudomonas sp. D 946-В 83 используют для инокулировапия затравочной среды, содержащей, %: глюкозы 3,0; рыбной муки 2,0; соевой муки 0,5; пептона 0,2; СаСОз 0,6. Перед стерилизацией устанавливают рН 7,0. Затравочную культуру инкубируют при 28°С в течение 48 ч на ротационной качалке и 22 мл культуры переносят в 100 мл ферментационной среды, находящейся в 500 мл колбе Эрленмейра, в которой находится, %: глицерина 2,0; льняной муки 2,0; арахисовой муки 1,0; рыбной муки 2,0; (НП4)25О4 0,3; СаСОз 0,5. Количество антибиотика достигает максимального значения через 3-5 дней при 28°С. Антибиотическую активность в фер4
ментационном бульоне определяют методом определения диффузии в системе «бумажный диек-агар с использаванием Bacillus subtilis PCI 219. Получают антибиотика 1500-2000 мкг/мл.
После получения бульона оптимальной активности устанавливают рН 2, основной водорастворимый антибиотический комплекс отделяют от мицелия и растворяют в
водной ферментационной ереде. Бульон фильтруют и фильтрат, содержащий антибиотик, нейтрализуют до рП 7 и пропускают через катионообменную смолу (амберлит в аммониевой форме). Затем смолу
промывают водой и -разбавляют NH40n, а антибиотик элюируют со смолы подходяnuiM элюентом. Активные порции элюента объеди}1яют, копцептрируют и выпаривают или лиофилизируют с получением антибиотика. При ПОМОН1И тонкослойной хроматографии получают сырое твердое вещество, которое еодержит три активных компонента А, А2 и В, а также два неактивных компонента С и D.
Антибиотик разделяют на компоненты А, Ад, В, С и D при помощи катионообменной смолы типа Амберлит G-50 в аммониевой форме. После растворения антибиотика в воде его обрабатывают смолой, промывают
водой, разбавляют гидроокисью аммония и элюируют подходящим элементом. 20 и. гидроокись аммония позволяет получить компоненты А и В, дальнейшее элюировани-е колонны более концентрированным раствором гидроокиси аммония нозволяет получить компоненты С и D. Чтобы получить очищенный компонент А2, необходимо осуществить дополнительное хроматографирование па колонке фракции А е целью разделения компонентов А2 и А.
Антибиотическое вещество А представляет собой белое аморфное основание, растворимое в воде, слегка растворимое в метаноле и этаноле и практически нерастворимое в н-бутаноле, ацетоне и других органических растворителях.
Антибиотик А способен образовывать соли при взаимодействии е кислотами. Фармацевтически применимыми являются нетоксичные соли таких органических и неорганических кислот, как хлористоводородная, серная, фосфорная, уксзсная, стеариновая, пропионовая, винная, малеиновая,
бензойная, янтарная и т. п.
Антибиотик А дает положительную реакцию с нингидривовым и антроповым реагентами, но отрицательные реакции с реагентами Tollens, Fehling и Sakaguehhi.
Удельное вращение (плоскости поляризации) компонента А в виде основания составляет yj 78,5°.
Образец антибиотика А после осаждения из этанола был подвергнут элементному
5
анализу, согласно которому вещество имеет формулу C.oHaiNaOgXCsHsOHXHaO.
Вычислено, %: С 44,24; Ы 8,52; N 9,11; О 38.13.
Найдено, % :С 44,25; Н 8,08; N 9,11; О (по разнице) 38,56.
Ди-Ы-ацетат антибиотика А получают в виде бесцветных игл, т. пл. 149-150°С, мол. вес. 481 (осмометрическим методом).
Вычислено, %: С 45,68; Н 7,47, N 8,41; О 38,44.
С.эНзйМзОнНгО.
Найдено, %: С 45,673; Н 7,49; N 8,19; О (по разнице) 38,59.
Антибиотик А представляет собой слабоосновное вещество и имеет способные к титпозаиию груплы, имеющие значения рКа 6,90 и 9,40 в воде. Нриблизительный молекулярный вес антибиотика, на основании вычислений по данным титрования, составляет 398.
Антибиотический компонент А2, подобно компоненту А, описанному выше, представляет собой белое аморфное основное вещество, которое растворимо в воде, слабо растворимо в метаноле и этаноле и практически не растворимо в н-бутаноле, ацетоне и других традиционных растворителях. Оно способно к образованию солей при взаимодействии с кислотами и фармацевтически применимых солей. Компонент АЗ дает положительную нингидриновую реакцию и положительную антроновую реакцию и отрицательные реакции при взаимодействии с реагентами Tollens, Fehling и Sakaguchi.
Для основания АЗ 79.Г (с 0,43, Н.О).
Образец антибиотика А2, выделенный в виде карбоната, был идентифицирован как CieHasNsOgXVsHaCOs.
Вычислено, %: С 44,79; Н 7,75; N 9,50; О 37,96.
Найдено, %: С 44,35; Н 7,83; N 9,21; О (по разнице) 38,61.
Антибиотик В аналогичен по внещнему виду и растворимости антибиотикам А и АО и представляет собой белое аморфное основное вещество, которое растворимо в воде, слегка растворимо в метаноле и этаноле и практически не растворимо в н-бутаноле, ацетоне и других традиционных органических растворителях.
Антибиотик В способен к образованию солей при взаимодействии с кислотами. Дает положительные реакции с нингидрином и антроном и отрицательные реакции с реагентами Tollens, Fehling и Salxaguchi.
Удельное вращение антибиотика В в виде основания составляет a 85° (с, 1,0, вода).
Образец антибиотика В при осаждении из этанола был идентифицирован как CnHsaNsOoXCzHsOHyHaO,
G
Вычислено, %: С 42,95; Н 8,34; N 9,36; О 39,35.
Найдено, %: С 42,69; Н 7,78; N 8,86; О (по разнице) 40,67.
Ди-К-ацетат антибиотика В получают в виде бесцветных призм, т. нл. 159-162°С, мол. вее 484 (методами осмометрии).
Вычислено, %: С 44,53; Н 7,27; N 8,66; О 39,54. С,8Нзз зО„ХН,0.
Найдено, %: С 44,96; Н 7,44; N 8.52; О (по разнице) 39,08.
Антибиотик В представляет собой слабое основание и имеет способные к титрованию группы со значениями рКя 7,15 и 9,35 в воде. Как было вычислено из данных титрования, приблизительный молекулярный вес антибиотика составляет 409.
Биологически неактивный пптибиотп ский компонент D представляет собой белое аморфное основное вещество, которое растворимо в воде, слабо растворимо в метаноле и этаноле и практическ нерастворимо в н-бутано.тс, ацетоне п других традиционных органических растворителях. Вещество D способно образовывать соли при взаимодействии с кислотами.
Компонент D дает положительные реакции с нингидрином и антроном, но отрицатель5 ые реакции с реагентами Tollens, Fehlinfj и Sakaguchi.
Удельное вращение компонента D в виде осиования составляет 72,5° (с 1,0, вода).
Образец компонента D, выделенный в виде карбоната, был идентифицирован как С.аНотЫзОзУНзСОз.
Вычислено, %: С 38,70; Н 7,25; N 10,42; О 43,63.
Найдено, %: С 38,86; Н 6,93; N 10,14; О (по разнице) 44,07.
Компонент D представляет собой слабое основание и пмеет три способные к титрованию группы с величинами рКя 6,95 (2 эквивалента) и 9,68 в воде.
Три-Ы-ацетат компонента D получают в виде бесцветных призм, т, пл. 159-162°С. Эта соль оказалась идентичной ди- -ацетату компонента В.
Определение структуры компонентов А и В.
.Мягкий кислотный гидролиз компонентов А и В дает такое же дезацпльное соединенпе С 2Н97Хз08, которое идентично компоненту D, полученному хроматографнческим разделением сырого комплекса антибпотнка. Общее N-ацетилирование антибиотика дало три-Н-ацетат (С18НззКзОп), который был идентифицирован как ди-М-ацетат компонента В.
Кислый гидролиз компонента В в метанольном растворе хлористоводородной
кислоты (насыщенный раствор, температура начала отекания флегмы, 24 ч) прпводит к получению агликона н аминосахара совместно с компонентом D. Агликон выделяют в виде крнеталличсского сульфата, т. пл. 263-264°С, который был кдентифицировап как CsHi6No04H2SO4.
Вычислено, %: С 25,90; Н 6,52; N 10,07; S 11,52.
Найдено, %: С 26,10; Н 6,47; N 9,93; S 11,29.
ЯМР-спектр, снятый при 220 MHrN, о-гексаацетата этого вещества совместно с даннымн масс-спсктрального анализа, полученными при использовании N-ацетил-оTMS N-ацетил-диизопронилидена и гексаN-0, N-ацетнл производных агликона, позволяет предположить 1,4-диамино-2,3,5,6тетра-ольную структуру для агликоновой части.
Ди-К-ацетат агликона получают в виде бесцветных игл, т. пл. 114-115°С.
Вычислено, %: С 45,45; Н 7,63; N 10,60.
C.oHzoNaOs.
Найдено, %: С 45,37; Н 7,97; N 10,57.
Аминосахарный фрагмент, полученный после описанного кис;1ого метанолиза компонента В, очнщают хроматографировапием на Амберлите G-50 и разделяют на схи (3-формы метилгликозида, причем а-форма - основной продукт. N-ацетилированием а-метилгликозида получают вещество в виде бесцветных призм, т. пл. 185-186°С.
Вычислено, %: С 45,95; Н 7,28; N 5,95.
CgHirNOe.
Найдено, %: С 45,93; Н 7,43; N 5,88.
Масс-спектр этого N-ацетильного производного дает пик при т/е 204 (М-31), соответствующий потери молекулой гликозидной метоксильной группы. Таким образом, свободный аминосахар должен иметь формулу CcHisNOsа- и р-формы метилгликозида идентифицированы как метил-4-амино-4-диокси-а- и p-D-глюкопиранозид соответственно в результате снятия ИК- и ЯМР-спектров их тетра-N, о-ацетилпроизводных. ИК-спектры искусственных образцов этих Сахаров, выделенных из 4-трехалосамина, соответствуют ИК-спектрам экеисрименталькых образцов.
Кислый гидролиз компонента D дает те же самые агликон и амикоеахар, что были выделены из гидролизата компонента В.
Компонент С, полученный хроматографическим разделением сырого комплекса антибиотика, подвергают гидролизу в среде метанола, содержащего 1 н. НС1, при температуре стекания флегмы в течение 3 ч. Агликоновый фрагмент идентичен этой части в других компонентах антибиотика, и фрагмент сахара идентифицирован как метил D-глюкозид с иомощью тонкослойной хроматографии, ЯМР- и хроматографии.
В опытах in vitro показано, что антибиотик и и 1дивидуальныо аитибиотические компоненты А, Д; и в обладают щироким
спектром антибактериальной активности. Антибиотик и активные компоненты ингибируют больи1инство аминогликозидустойчивых организмов. Обнаружено, что комповент А2 является более активным по срав 1ению с компонентом В, но менее активен чем А.
Минимальную ингибирующую концентрацию А и В определяют по отношению к
больщому количеству бактерий способом двукратиого разбавления агара в чащкахс питательным агаром. Для этой цели использ аот иноколумрепродуцирующее устройство. Количество прививочного материала поддерживают таким, чтобы оно составляло разбавление в 10 раз оставленной на ночь культуры испытуемых организмов в сердце-пептонном бульоне (Direc). Удельные активности компонентов А и В
умеренные или достаточно слабые в отноп:енпи значений минимальной ингибиторной концентрации (МИК), причем комиоиен А в 2-4 раза более акт1:пеи, чем В. Однако они имеют широкий спектр антибактериальной активности против грамположительных и грамотрицательных бактерий, включающих многие аминогликозидустойчивые организмы и штаммы.
Установлено, что антибиотик с чистотой
30-40% ингибирует Е. соИ А 20365 при концентрации 12,5 мкг/мл, К. pneumoniae D-11 при концентрации 1,5 мкг/мл, и Ps. aeroginosa А 9930 при концентрации 25 мкг/мл.
Влияние рН на МИК.
Влияние рН среды на МИК комионента А изучают методом двойного разбавления агара с иснользованием среды иитательного агара при рН 6,0, 7,0, 8,0 и 9,0. Результаты показывают, что активность компонента А увеличивается в среде с . щелочным рН и уменьшается в среде с кислым рН.
Влияние среды на активность компонентов А и В изучают по отношению к 8-ми испытуемым организмам. В качестве испытуемых сред используют питательный агар, сердце-пеитонный агар и Mueller-Hintoorap. рН среды устанавливают 8,0. Наибольшая
активность in vitro проявляется при использовании в качестве испытуемой среды питательного агара.
Активность и токсичность компонентов А и В оценивают in vivo при экспериментальном заражении мышей. В качестве патогенных бактерий используют S. aureus snith, Е. coli № 1 HJ и Ps. aeroginosa A 9930. Мышей заражают 100X4050 дозой патогенов в 5%-ной сусиензии желудочного
муцина свиией, единичное иодкожное введение антибиотика осуществляют немедленно после бактериального заражения (О ч) и двойную дозировку антибиотика вводят через О или 3 ч после заражения.
Для каждого дозировочного уровня исполь9
зуют группы в 5 мышей, н животных наблюдают в течение 5-ти дней для определения средней защитной дозы LDooКомпоненты А и В проявляют активность in vivo против всех трех испытуемых бактерий.
Острую токсичность компонентов А и В определяют на мышах при подкожном и внутривенном применении. Мышей наблюдают в течение 15-ти дней. Внутривенная (i. V.) и подкожная (s.e.) LDso компонента А составляет 2500 мг/кг и 1000 мг/кг соответственно. Компонент В значительно менее токсичен, чем А, и не вызывает смертельного исхода при дозировках вплоть до 2000 мг/кг как при внутривенном, так и при подкожном применении в течение 15дневного периода наблюдения.
Компонент D, хотя он и является биологически неактивным, представляет собой ценное промежуточное вещество в полусинтстическом получении биологически активных KOjMnoH€HTOB А, А2, В. Так, например, свободная аминогруппа промежуточного вещества D (после соответствующей защиты других реакционноспособных функциональных групп) может быть подвергнута N-ацилированию в соответствии со способами, известными per se, с образованием (после удаления любых защитных групп) N-бутирильного производного А, N-ацетильного производного В и N-пропионильного производного А2.
Пример 1. Ферментация в чане.
Штамм D 946-В 83 культуры Pseudomonas на косом агаре используют для инокулирования 100 мл затравочной среды №83В (3% глюкозы, 2% рыбной муки, 0,5% соевой муки, 0,2% пептона и 0,6% СаСОз) в 500 мл колбах Эрленмейра. Колбы инкубируют при 28°С в течение Здней на ротационной мешалке (250 об/мин), и используют 1 л затравочной культуры для инокулирования 300 л ферментационной среды № 100 (2% глицерина, 1% Pharmainedia, 2% рыбной муки, 2% муки льняного семени, 0,3% (NH4)2S04, 0,6% СаСОз). Ферментацию в чане проводят при 30°С, перемешивании со скоростью 140 об/мин, при скорости аэрации 200 л/мин. Активность бульона определяют методом «бумажный диск-пластина агара с использованием В. subtilis PCI 219 в качестве образца для анализа и ВИ 2183 А - в качестве стандарта для анализа. Полученные результаты представлены в табл. 1.
Пример 2 (экстракция). Созревший бульон фильтруют при рН 2. Фильтрат (19 л), который содержит около 30 г антибиотика А, доводят до рН 7 и перемешивают с 13 л Амберлита LRS-50 (ЫН4+-форма). Смолу отделяют, промывают 10 л воды и 5 л 15 н. NH40H, затем перемешивают с двумя 4-литровыми порциями 2н. NH4OH для элюирования. Активные .элюа10
Т а б л 1 ц а 1
10
15
ты объединяют, концентрируют в вакууме и затем лиофилизируют с получением 18,6 г белого твердого вещества (около 700 мкг/мг). Это твердое вещество растворяют в воде и пропускают через колонку с Амберлитом G-50 (НН4+-форма, 400 мл). Колонку промывают 2,2 л воды и 3 л 4 н. NH40H и затем элюируют 20 н. NH4OH. Элюаты собирают по фракциям и исследу5ют методом биологического анализа на пластине с В. subtilis, а также методом тонкослойной хроматографии (система S-117, нингидрин).
Соответствующие фракции объединяют, концентрируют в вакууме и лиофилизируют с получением твердых веществ. Результаты представлены в табл. 2.
Таблиц а 2
35
40
45
Пример 3. Получение компонента А. Сырой образец компонента А (2,7 г), полученный в примере 2, растворяют в воде и пропускают через колонку с Амберлитом G-50 (NH4+, 80 мл). Колонку элюируют 20 н. NH40H и каждые 15 мл элюата собирают при помощи фракционного сборника. Фракции исследуют методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) и реакцией на нингидрин, а также биологическим анализ(1м. Соответствующие фракции объединяют, концентрируют в вакууме и лиофилизируют с получением твердых веществ. Результаты представлены в табл. 3. Чистый препарат компонента А идентифицирован как CisHaiNsOgXAnoCOa.
Вычислено, %: С 43,45; Н 7,53; N 9,81. Найдено, %; С 43,22; Н 7,52; N 9,49.
11
Таблица 3
12
объединяют, концентрируют в вакууме н лиофилизируют с получением твердых веществ. Результаты представлены в табл. 5,
Таблица 5
Пример 4. Получение компонента В.
Сырой образец компонента В (3,3 г), полученный в примере 2, растворяют в воде и пропускают через колонку с Амберлитом G-50 (NH4+, 130 мл). Колонку элюируют 20 н. NH4OH, и каждую порцию элюата---по 15 мл- собирают фракционным сборником. Фракции исследуют методом тонкослойной хроматографии и реакцией на нингидрин, а также биологическим анализом. Соответствующие фракции объединяют, концентрируют в вакууме и лиофилизируют с получением твердых веществ. Результаты представлены в табл.4.
Таблица 4
Чистый препарат компонента В идентифицирован как С14Н29МзО9Х 2Н2СОз.
Вычислено, %: С 42,02; Н 7,30; N 10,14.
Найдено, %: С 41,92; Н 7,43; N 9,93.
Пример 5. Получение компонента С и компонента D.
Колонку, используемую в примере 2, далее проявляют 1,4 л 20 н. NH4OH, в результате чего не происходит элюирования биологически активного вещества. Затем колонку цроявляют 10 н. NH40H, и элюаты исследуют методом тонкослойной хроматографии с опрыскиванием нингидриновым реагентом. Соответствующие фракции
Пример 6. Получение компонента АЗ. В ходе процесса очистки компонента А, описанного в примере 3, выделяют активный компонент из предыдущих фракций, который обозначен как компонент АЗ. Его отделяют от компонента А системой для тонкослойной хроматографии S-117 и8-122. Результаты представлены ниже:
ААЗ
S-1170,490,57
S-1220,390,48
Формула изобретения
Способ получения антибиотика общей формулы
снок
сн
он о
CrfflH
снон
где R - CHsCHsCONH, CHgCONH,
СНз(СН2)2СОЫН, NH2,
отличающийся тем, что штамм Pseudomonas sp. Д 946-В 83 АТСС 31086 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при рН 5,5-9,5 и температуре 10-32°С с последующим выделением целевого продукта в свободном виде или в виде производных солей.
