Способ получения пировиноградной кислоты Советский патент 1986 года по МПК C12P7/40 C12R1/73 C12P7/40 C12R1/73 

I

Изобретение относится к области микробиологического получения органических кислот, в частности пиро- виноградной кислоты, и может быть использовано в микробиологической, химической, пищевой и медицинской промышленности.

Пировиноградная кислота м ожет служить как исходный материал для производства таких аминокислот, как триптофан, тирозин или аланин, а также используется как добавка к продуктам для придания им кислого вкуса.

Целью изобретения является п-овы- шение выхода пировиноградной кислоты.

Выход пировиноградной кислоты может быть значительно увеличен путем дискретной подачи глицерина в среду (периодической подпитки) в процессе культивирования. При таком способе (табл.1 внесения субстрата количество накапливающей- в культуральной жидкости кислоты в 1,5 вьше, а период ферментации в 1 ,4 раза короче по сравнен:ию со способом, где то же количество глицерина вносится одноразово в начале культивирования.

Влияние дискретной подачи глицерна на выход пирувата (Candida fipo- Tytica 695, культивирование в колба на качалке ) приведено в табл. 1.

При дискретном способе подачи глицерина последний вносят в среду таких- количествах и через такие промежутки времени, чтобы его концентрация непосредственно после внесени не превьшала 46 г/л. Как видно из табл,2, при концентрации глицерина в среде до 46 г/л количество кислоты увеличивается пропорционально количеству субстрата. При содержани же его в среде 50 г/л и выше наблюдается значительное снижение выхода пировиноградной кислоты вследствие ингибирующего влияния высоких концентраций глицерина на дрожжевые клетки.

В процессе культивирования нецелесообразно допускать снижение концентрации глицерина ниже 1 г/л, так как это приводит к полному потреблению субстрата за короткий- промежуток времени и приостановке процесса федментации.

Влияние концентрации глицерина в - среде на выход пировиноградной кис490692

.лоты у C.PipoEytica 695, приведено

в табл.2.

-Увеличение выхода пировиноградной кг слоты и сокращение времени фермента

. ции при дискретном способе подачи глицерина в среду поясняется примерами и табл.. .

По способности к биосинтезу пировиноградной кислоты (табл.3) пр ове10 ренные штаммы Candida Pipo-fytica не имеют существенных отличий от штамма, используемого в прототипе, при культивировании их в идентичных условиях (в колбах на качалке) в

15 среде с глицерином.

Содержание пировнноградной кислоты в культуральной жидкости дрожжей fipoEytica приведено в табл. 3..

2Q Пример. Опыт. Дрожжи

Candida HpoEytica 695 (BKM-Y-2378) выращивают в течение 2 сут при 28- 30°С в пробирках на агаризованной минеральной среде Ридер следующего

25 состава, г/л: глицерин 20;(NH)2SO 3,0; MgS04-7H O 0,7; NaC 0,5;

CaCNOj) jAis. I,о; 0,1;

агар-агар 25; дрожжевой автолизат 2 №Tj микроэлементы (смесь Бурк- цп гольдера), мг/л: KI 0,1, В 0,ОГ,

Мп- 0,0 ;Zn - 0,01 ; ,01;

0,01, 0,05; вода бидистил- лированная.

Клетки из одной пробирки смывают

5 мл стерильной дистиллированной ВОДЬ в колбу объемом 750 мл с 50 мл среды следующего состава, г/л: глицерин (NH) SO 3,0; 0,7; CaCNOjj 0,4; NaC| 0,5; 1,0; KjHPO 0,; тиамин 2 МКГ/Л, микроэлементы по прописи Буркгольдера, вода бидистиллиро- ванная.

Посевной материал выращивают

24 ч на качалке 220 об/м/мин/ при 28-30 с, Колбы в опытных вариантах засевают из расчета 100 мг клеток (по весу сухой биомассы) на л среды того же состава, которая

использовалась для выращивания

посевного материала, но количество глицерина увеличивают до 60 г/л и его вносят по 20 г/л в .начале, и через 36 и 72 ч культивирования,

55 когда концентрация в среде соотвест- венно снижается до 5 и 10 г/л. Таким образом, концентрация глицерина сразу после внесения составляет в

40

3

.начале процесса 20 г/л, чере 25 г/л, через 72 ч - 30, г/л (,-1)

Культивирование ведут в колбах на качалке до полного потребления субстрата при рН 3,5-6,0 {поддерживают добавлением 5%-ного раствора NaOH). Изменение концентрации гл1ще рина в процессе фермента1дии от 5 до 30 г/л не оказывает влияния на динамику накопления кислоты (фиг.)

Через 5 сут культивирования в среде накапливается 36,4 г/л пиро- виноградной кислоты, что составляет 60,7% от потребленного субстрата.

Контроль. Выращивание дрожжей ведут как в опытном варианте, но 60 г/л глицерина: вносят одноразово в начале культивирования. Субстрат полностью потребляется за 7 сут, за это время накапливается 24,2 г/л пирувата -(выход 40,3 % от потребленного: глицерина).

Таким образом, при дискретном внесении глицерина в среду количество образующегося продукта увеличивается в 1,5 раза, а время ферментации сокращается, на 48 ч.

Приме р 2, Опыт. Дрожжи Candida ipo ytica 695 (ВКМ Y-2378) выралщвают на агаризованной среде как в примере 1. Для приготовления посевного материала используют среду следующего состава, г/л: глицерин зо; (Ш4)2Я04 6,о; Mg so 7Н20

1,4; NaCl 0,5; CaCNOj) 0,8; KH, 2,0; 0,2, микроэлементы - удвоенная концентрация (по сравнению со смесью Буркгольдера, тиамин 6 мкг/л. Посевной материал выращивают в колбах на качалке (220 об/мин)24 ч.

Последующее культивирование с целью получения пировиноградной кислоты проводят в ферментере объемом 10 л с 5л среды, имеющей такой же состав минеральных солей, как и i среда для посевного материала. Концентрацию тиамина снижают до 4 мкг/л количество глицерина увеличивают до 100 г/л.

Посевной материал вносят из расчета 0,4-0,5 г/л (по сухому весу) , Культивирование проводят при , рН 4,5, концентрации растворенного кислорода 60%-от насьщения.

490694

Посто.яииьгй уровень рН поддержива- .. ют путем нейтрализации 10%-ггым раствором NaOH,

Глицерин вносят .следующим обра- J зом: 20 г/л в начале процесса и по 20, 10, 15, 35 г/л через 12, 23, 26 и 32 ч выращивания, когда его кон- центра1Шя соответственно сннлсается до 3,1з5 и П г/л. Таким образом, to концентрагдая глицерина непосредственно после внесения в среду в разные Промежутки времени составляет 20,23 1,2pj 46 г/л.

За 50 ч происходит полное потре,б- f5 ление г.пицер1-ша и накапливается 5 ,8 г/л пир гвата. Изменение кон центрации глицерина от 1 до 46 г/л не оказывает влияния на динамику накопления кислоть фиг. 2 ). 20 Контроль о Культивирование ведут как в опытном варианте, но 100 г/л глицерина вносят в начале процесса. Ферментация заканчивается к 72 ч, в среде обнар гжено 38,5 г/л пирови- 25 ноградной кислоты.

Таким образом, при. дискретной подаче глицерина выход.кислоты увеличивается в 1,34 5, а время ферментации сокравдается почти Б 1,5 ра-

за..

Приме р 3. Культивирование ведут, как в примере 2, но 100 г/л глицерина вносят следующим образом: 20 г/л в начале ферментации, затем 44 и 36 г/л через 12 и 38 ч куль ти- , вирования, когда его концентрация соответственно снижается до 5 и 10 г/л. После внесения глицерина она составляет 49 г/л после первой и 46 г/л после второй добавки.

Ферментация закаьгчивается через 58 ч, выход кислоты составляет 42,4 г/л (42,4% от потребленного субстрата). Таким образом, увеличение концентрации глицерина в среде до 49 г/л при дискретной его пода- че на 9,4% снижает выход пирувата (по сравнению с примером 2) и на 8 ч увеличивает время ферментации.

Таким о.бразом, культивирование дрожжей Candida .fipofytica по предлагаемому способу на среде, содержа- щей в качестве источника углерода непищевое сырье.- глицерин позволяет увеличить накопление пировиноградной кислоты в культуральног жидкости в 4,6-6,1 раза по сравнению с известным способом и в 1,15-1,2 раза по сравнению со,способом, по которому до настоящего времени был получен лучший выход пировиноградной кислоты - 43,6 г/л,но согласно которому используют в качестве источника углерода пищевое сьфье - глюкозу и де фицитную незаменимую аминокислоту - метионин.

60(20+20+20; Дискретный36,4

60. Одноразовый24,2

t

ГОтамм, используемый по известному способу.

Кроме того, как видно из преДстат ленного материала, дискретное внесение глицерина в среду в процессе

культивирования по сравнению с одно- рлзовым внесением увеличивает также выход пировиноградной кислоты от потребленного субстрата в ,34- 15 5 раза и сокращает время ферментации в 1,4-1,44 раза.

Т а б л и ц а 1

60,7 40,3

120 168

Таблиц а2

ТаблицаЗ

Пиро6иногр.к-та, /л Глицерин

50

fto

30

20

W

О

10

20

V.

30

40

50

Время культиёиробания, часы Фиг. 2

Редактор П.Коссей

Составитель Н.Афанасьева

Техред В.Кадар Корректор Е.Сирохман

Заказ 4202/27 Тираж 490Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул. Проектная, 4