Способ получения изолимонной кислоты Советский патент 1983 года по МПК C12P7/48 

(5t) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ изолимонной кислоты

1

Изобретение относится к микробиологической промьшленности, а именно к способу получения изолимонной кислоты, используемой в различных отраслях промышленности, на, пример медицинской, химической и др,

Изолимонная кислота метаболически близка лимонной кислоте и может найти применение в тех же областях ,народного хозяйства, где используется последняя, и производство которой не обеспечивает в достаточной степени потребности в ней (электррнная, металлургическая, текстильная промышленность; при производстве поверхностно-активных веществ, а

также синтетических моющих средств вместо триполифосфатов натрия и калия , загрязняющих фосфором водные бассейны). Изолимонная кислота исг. пользуется как биохимический препарат в исследовательной работе, бднакб стоимость ее очень высока.

что значительно ограничивает области ее применения.

Известен способ получения изолимонной кислоты с использованием дрожжей вида Candida lipolytica, предусматривающий выращивание их на питательной среде при аэрации среды, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные оли l. Наряду с изолимонной кислотой в ферментационной среде обнаруживают и лимон ную кислоту.

Известен также способ производства изолимонной кислоты при культивировании дрожжей Candida brumptU 1FO в питательной среде с н-гексадеканом (60 гУл), получают 30,0 г/л изолигюнной кислоты (с выходом 50 от внесенного алкана, лимонной кислоты Б среде не обнаруживают 2.

Наиболее близким техническим решением к описываемому по достигаемому эффекту является способ получения 3B изолимонной кислоты путем культивирования дрожжей видд Candida lipoly tica в условиях аэрации на питатель ной среде, содержащей этиловый спир в качестве единственного источника углерода, азот, фосфор и минеральны соли 3. При культивировании дрсякжей Candida lipotyttca на питательной среде, содержащей 2,0 этаноЛа, выход изолимонной кислоты составляет 60-66% от внесенного субстрата. Рассматриваемый способ не обеспе чивает достаточно высокого выхода изолимонной кислоты. Целью предлагаемого изобретения является повышение выхода и концен рации изолимоиной кислоты. Поставлен 1ая цель достигается те что в способе получения изолимонно кислоты, предусматривающем культиви рование дрожжей вида Candida lipoly tica в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли, в питательную среду в процессе культивирования вносят ингибитор) изоцитрат-лиазы в концентрации 1,0-БП,0 мм. При этом, в качестве ингибитора используют итаконат или оксалат натрия , а в качестве источника углерода - нормальные парафины или этанол. Использование предлагаемого спосо ба позволит наладить производство изолимонной кислоты из вьоиеперечисленных источников углерода с выходом этого продукта, превышающим все известные достижения в этой области. Добавление к ферментационной среде итаконата или оксалата. даже в неболь ших концентрациях сдвигает соотношение накапливаемых в растворе лимонно и изолимонной кислот в сторону изолимонной, что облегчает процессы выделения в химомистки последней. Пример 1. Дрожжи Candida lipolytica ИБМФ У-160 поддерживают на агаризованной минеральной среде Ридер с нормальными алканами (Ofт. 0(9 имеющей следующий состав, г/л: Нормальные алканы Йа- 0,98,0 (NH.)iS043,0 МдЗбд.,7 ,5 CalHO)Q,k КНгР04.1,0 К НРОд0,1 Агар-агар25,0 Дрожжевой автолизат2,0 мл Смесь микроэле лентов поБуркгрльдеру 5,0 мл Набор микроэлементов по Буркгольдеру включает следующие компоненты (мг/л среды): К1-0,1; В - 0,01; 0,01; ,01; Си - 0,01; Мо - 0,01; - 0,05/, Дрожжи вы ращивают на скошенном агаре в течение двух сут п)эи 28-30 С. Водную суспензию клеток с агаризованной среды переносят в колбы 750 мл,содержащие 50 мл посевной среды следующего состава, г/л: н-гексадекан 8,0 , (NH) S04. 3,0 MgS0.4-7H-00,7 ЫаСг0,5 Ca(NO,.)«О, КН,,0 0,1 Тиамин 500 мкг микроэлементов 5,0 мл Выращивание проводят Л8 ч на качалке (260 об/мин) при 28-30 С. Полученный посевной материал вносят в количестве 2% в среду для ферментации, которая осуществлялась также в колбах объемом 750 мл с 50 мл среды аналогичного состава. Через 2 ч от начала культивирования в кол вносят итаконат натрия в различных концентрациях. рН среды подде }живают 5,5-6,5 путем добавления 10% NaOH. В табл.1 приведены результаты, полученные после четырех сут культивирования. Из таблицы видно, что добавление в среду итаконата приводит к изменению соотношения накапливаемых кислот в сторону изолимонной кислоты (по сравнению с контролем) и тем самым повышает выход последней от использованного субстрата. Пример 2. Дрожжи Candida lipolytica ИБФМ У-1бО поддерживают и выращивают на питательной среде того же состава, как описано в примере 1. Через 2 ч культивирования в опытные колбы вносят оксалат натрия в различных концентрациях. В табл.2 приведены результаты определения содержания в культуральной жидкости лимонных кислот после. 9б ч культивирования. Полученные данные показывают, что использование оксалата также повышае выход изолймониой киспбты. П р и н ер 3. Дрожжи Candida llpolytlca ИБМФ У-160 поддерживают на агаризованной минеральной среде Ридер, имеющей такой же состав,как в примере 1. В качестве источника углерода используюг этанол (10,0 г/л Культуру выращивают на С1(ошенном агаре в течение трех сут при 28-ЗО С Водную суспензию клеток с агаризован ной среды переносят в колбы объемом 750 ил, содержащие 50 мл посевной среды. Среда для получения посевного маг териала имеет следующий состав, г/л (NH4.S04 0,3 gSOWK O 0,7 NaCl0,5 Ca(NO)2 О, KHiP041,0 KjHPO 0,1 Этанол10,0 Тиамин . 500 мкг Смесь микроэлементов5,0 мл Выращивание проводят 48 ч на качалкёС2бО об/мин при 28-30 С. Полученную посевную .культуру переносят в новую партию колб со средой того же состава в количестве 5% от объе ма среды. Через 2 ч от начала культивирования в колбы вносят итаконат нат рия в концентрации 5 мМ. рН среды во время культивирования поддерживали равным ,5 введением раствора NaOH. Череа 5 сут культивирования в среде накапливается 7,2 г изолймон ной кислоты и 2,0 г лимонной кисло ты в 1 л. Выход изолимонной кислоты составляет 72% от внесенного субстр та. В колбах без Добавления итаконат обнаруживается 6,.i г изолимонной и 2,k лимонной кислоты. Пример . Дрожжи Candida lipolytica ИБФМ У-160 выращивают на скошенном-агаре, как в примере 1. Водную суспензию клеток с агаризова ной среды переносят в колбы объемом 750 мл, содержащие 50 мл посевной среды следующего состава, г/л: Нормальные парафины (с,а- Qf9) 2i.,o (NN4)5042,0 Мд50д.7НаО 0,7 NaCI0,5 Ca(NO,LО, КНгР04.1,0 К НР040,1 Соль Мора .3,5 мг Тиамин500,0 мкг Смесь микроэле. . ментов5 0 МП Через 18 ц инкубации на качале (260 об/мин ) полученную посевную ультуру переносят в новую партию о.пб с посевной средой, объем иноу люма - 5 от объема среды. 500 мл выросшей культуры переносят ферментационную среду (3,5 л)еле-, ующего состава, г/л: Нормальные парафины (С.- ,0 (NH4)4 S042, Мд501-7НЖ1, NaCl0,5 Ca(NQ.V0,8 KHj POj2,0 KjHPq 0,2 Соль Мора3,5 Тиамин500,0 мкг . Смесь микроэлементов5,0 мл Через 2( ч и 50 ч от начала куль тивирования в ферментационную среду добавляют итаконат натрия в концентрации 5, Р г/л (конечная концентрэция итаконата 10,0 г/л). Ферментацию проводят в ферментационном аппарате при постоянном перемешивании и поддержании концентрации кислорода в среде насыщения. рН среды поддерживают на уровне 5,,5 введением раствора NaOH. Через (( ч культивирования в среде накапливается 67,0 г/л изоли- -. монной кислоты и 29,0 г/л лимонной кислоты. Кроме того определено 23, г/л неиспользованного парафина. Выход изолимонной кислоты от потребленного субстрата составляет 100%. Соотношение лимонной и изолимонной кислот - 1:2,3. При проведении ферментации на питательной среде, содержащей 72,0 г/л нормальных парафинов без добавления итаконата, накапливается «8,5 г изолимонной кислоты ( выход 67,3 от 7 субстрата ) и 5,0 лимонной кислоты Соотношение кислот 1:1. Пример 5 Выращивание дрожжей на скошенном агаре, получение посевного материала и ферментационный процесс осуществляют, как в при,мере 2. Ферментационная среда содержит Нормальные парафины концентрации 100,0 г/л. Через 2k ч и $0 ч культивирования в среду вносили соответственно . , 2,0 г/л и 3,0 г/л итаконтата натрия (конечная концентрация итаконата 5,0 г/л). После И ч культивирования в ферментационной среде обнаружива1от 68,3 г/л изолимонной кислоты и .33,7 г/л лимонной кислоты). Концйнтрация остаточного парафина в среде 37,8 г/л. Выход изолимонной кислоты от использованного субстрата ;оетавляет 109, Соотношение лимонной и изолимонной кислот равно 1:2.

f.O

2,5 5,J 5,0

Выход изолимонной кислоты от субстрата, %

Соотношение кислот лимонная:изолимонная

,5 ,0 3,8

|,0 S. 6,6 6,4 5,0

1,7 1,75 1.75 1,5 1,8

6,2 6,8 5,0

6,0 6,k

80

85

78

62

1:3,5 1:3,6 1:3,5 1:,5 .1:3

Таблица 2

3,3 3,3 3,5 6,8 6,8 6,6 0 Выход лимонных кислот и их соотношение при культивировании дрожжей на среде без добавления итаконата был таким же, как описано в примере 4. Внесение в ферментационную среду итаконата или оксалата натрия в концентра14иях 1,0 до 6Q,0 мМ сдвигает соотношение экстретируемых дрожжами лимонных кислогг в сторону преимущественного накопления изолимонной кислоты, повышая, тем самым, ее концентрацию в ферментационном раст воре, а зто, в свой очередь,приводит к тому, что значительно облегчаются процессы выделения этой кислоты из раствора и последующей химочистки. Использование данного способа позволит одновременно повысить концентрацию изолимонной кислоты в растворе и ее выход, что приведет в снижению ее стоимости и расширению области ее применения. ° Таблица 1

Выход иэолимонной кислоты от суб62,5 68 82,5 80 страта, % Соотношение кислот лимонная:изолигюнная t:1,2 1:1,2 1:1,6 Формула изобретения 1.Способ полу|4ения изолимонной кислоты путем культивирования дрожжей вида Candlna Upolytica в услови ях аэрации на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, форфора и минеральные соли, 6 т л ичающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в питательную среду в прЬцессе культивирования вносят ингибитор изоцитрат-лиазы в концентрации 1,0-60,0 мМ 2.Способ по п.1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что в качестве ингиsiisyeo

to

Продолжение табл. 2

85 82,5

85 1:1,7 1:2,1 1:2,1 1:1,9 битора используют итаконат натрия или оксалат натрия. 3. Способ по 11.1, о т л и ц а юц и и с я тем, что в качестве источника углеррда используют нормальные парафины или этанол. Источники информации, принятые во внимание при,экспертизе 1.Авторское свидетельство СССР IP 305187, кл. С 12Б I/O, 1968. 2.Патент Франции ff 1596056, кл. С 12 d опублик. 1970. 3.Авторское свидетельство СССР по заявке IP 28 702/13, кл. С 12 Р 7А8, 1979.