Способ получения ростового протеина Советский патент 1986 года по МПК C12N5/00 A61K35/16 

Изобретение относится к биотехологии и может быть использовано ри работе с клеточными культурами в вирусологии.

Целью изобретения является упроение способа и повышение чистоты целевого продукта за счет улучшения осаждения целевого продукта.

Пример 1. К 80 мл сыворотки крупного рогатого скота добавляют 20 мл 40%-ного водного раствора по- лиэтиленгликоля с молекулярной массой 3000-4000 дальтон. Смесь интенсивно встряхивают. Полученную суспензию после экспозиции в течение 10-20 мин при комнатной температуре центрифугируют при 2000-3000 об/мин 10 мин.Надосадок сливают в 100-граммовый флакон, добавляют при встряхивании 15%-ный водный раствор уксус- ной кислоты из расчета 1,0-1,2 мл кислоты на 80 мл надосадка с последующим добавлением 20 мл 40%-ного раствора полиэтиленгликоля. Полученную взвесь тщательно встряхивают и выдерживают 10-20 мин при комнатной температуре и затем центрифугируют 10 мин при 2000-30006 об/мин. Надосадок удаляют, осадок однократно промывают заранее приготовленным забуференным физиологическим раствором рН 8,0-9,0 и растворяют в 100мл этого же растворителя. Полученный раствор подвергают ультрафильтрации через мембраны типа ИМ-2 фирмы Амикон до концентрации общего белка в препарате 4-6% .Затем препарат стерилизуют путем - фильтрации и используют в работе.

Пример 2. К 80 мл сьшоротки крупного рогатого скота добавляют 20 мл 35%-ного водного раствора по- лизтиленгликоля с ММ 3000-6000 даль- тон. Смесь интенсивно встряхивают. Полученную суспензию после экспозиции в течение 10-20 мин при комнатной температуре центрифугируют при 2000-3000 об/мин в течение 10 мин. Надосййок сливают в 100-граммовый флакон, добавляют при встряхивании 15%-ный водный раствор уксусной кислоты из расчета 1,0-1,2 мл кислоты на 80 мл надосадка с последующим добавлением 35%-ного раствора полиэтиленгликоля с ММ 5000-6000 даль- тон до конечной концентрации 14- 16%. Полученную взвесь тщательно

ВПШтИ Заказ 4376/20

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, А

встряхивают и выдерживают 10-20 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют 10 мин при 2000- 3000 об/мин. Надосадок удаляют, оса док однократно промывают забуференным физиологическим раствором рН 8,0-9,0 растворяют в 100 мл этого же растворителя. Полученный раствор подвергают ультрафильтрации через мембраны типа ИМ-2 до концентрации общего белка в препарате 4-6%.Затем препарат стерилизуют путем фильтрации и используют при культивировании клеток человека и животных. Способ осуществляют в течение 1 сут. тогда как известный способ занимает около 7 сут, позволяет получить более чистый препарат (содержание Y-глобулиновой фракции ме- нее 0,5%, в прототипе - 5-8%).

Ростовой протеин используют следующим образом.

Культивирование линии клеток , с применением ростового протеина.

Проведено 5 пассажей с посевной дозой 100000 кп/мл и 2 пассажа с посевной дозой 40000 кл/мл. При посевной дозе 100000 кл/мл в каждом пассаже клетки формируют монослой на 3-4 сут. Индекс пролиферации (ИП) после 5-го пассажа составляет 8,7. При посевной дозе 40000 клеток в МП монослой формируется на 5-6 сут ,2. При обеих использованных посевных дозах клетки в пассаже сохраняют типичную морфологию без признаков дегенерации. Культивирование линии диплоидных клеток М-19, с применением ростового протеина. Проведено 4 пассажа с посевной дозой 200000 кл/мп. В каждом пассаже клетки формируют монослой на 3-4 сут с характерной морфологией без признаков дегенерации. ИП пос- ле 4 пассажа - 2,05.

На первично-трипсинизированной культуре клеток куриных эмбрионов в возрасте 9-10 дней испытания ростового протеина на ростстимулиру- ющую активность проводились с концентрациями препарата, %: 10, 1, 0,5, 0,25, 0,12 при посевной дозе 300000 кл/мл. Монослой формируется на 2-3 сут. Препарат обладает рост- стимулирующей активностью в концентрациях 0,25 - 1.

раж 490Подписное